Introduction

小麦既是我们饮食文化的重要载体，又是联合国粮农组织报告的“八大”食物致敏原之一。据悉，美国约0.2%～1%的儿童对小麦过敏，欧洲约0.2%～0.5%的14岁以下儿童对小麦过敏。世界卫生组织和国际免疫学会联合会过敏原命名委员会已公布了28种食源性小麦过敏原。其中，麦谷蛋白（包含麦醇溶蛋白和麦谷蛋白）约占小麦全蛋白80%，是引起小麦过敏的主要致敏原，能引发小麦依赖性运动性过敏反应、面包师哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病，常伴有荨麻疹、血管性水肿、支气管阻塞、恶心、腹痛或全身过敏反应等临床症状。

近年来，肠道菌群逐渐凭借其在免疫系统中的调控作用逐渐成为研究热点。研究表明，肠道菌群能够通过调节抗原呈递、免疫细胞分化和黏膜屏障等功能来影响食物过敏。例如，肠上皮细胞经肠道菌群刺激分泌的Toll样受体（TLRs）可通过MyD88信号通路促进DC细胞增殖，进而影响抗原递呈过。处于稳态下的肠道菌群能够维持机体Th1/Th2反应平衡，而肠道菌群失调将打破该平衡，使其向具有促炎性的Th2反应倾斜，从而加剧食物过敏。

小鼠模型是研究食物过敏机制的主要工具，其构建常采用腹腔注射、灌胃致敏和经皮致敏等方法。为了探究不同致敏途径对小麦过敏的影响，中国农业大学食品科学与营养工程学院刘成龙、薛文通教授等在本实验中采用腹腔注射、灌胃致敏和经皮致敏三种方法构建小麦致敏小鼠模型，通过对不同途径致敏小鼠进行血清学分析，以寻找最佳的小麦蛋白致敏模型构建方法；另一方面利用16S rRNA高通量测序技术解析小鼠肠道菌群结构，探究不同致敏途径对小鼠模型肠道菌群的影响，为后续通过小麦蛋白致敏小鼠模型研究食物过敏与肠道菌群关系提供参考。

Results and Discussion

过敏小鼠临床症状表征

用做致敏原的小麦蛋白主要分布在25～100 kDa范围内，主要成分为麦谷蛋白（30～120 kDa）和麦醇溶蛋白（30～50 kDa）（图1A）。采用经皮致敏、腹腔注射和灌胃致敏等三种方式致敏小鼠，致敏方案如图1B所示。三种致敏方式均能使大部分小鼠致敏，但引起致敏临床症状的严重程度不同（图1C）。只有腹腔注射致敏组出现了严重的过敏症状（临床症状评分4～5）。经皮致敏和灌胃致敏组只表现出中度或轻度过敏症状（临床分数2～3），并且灌胃致敏组小鼠轻微症状的比例最大。且腹腔注射致敏组肛温变化最大（图1D）。

A：麦谷蛋白SDS-PAGE分析；B：试验设计；C：临床评分；D：各组小鼠肛温变化。

图1 试验设计及过敏症状表征

过敏小鼠血清抗体及组胺含量测定

在灌胃激发24 h后，处死小鼠并收集血清。测定IgA、IgG、总IgE、小麦蛋白特异性IgE和组胺浓度（2A-D）。致敏组血清中IgA、IgG、总IgE和小麦特异性IgE含量均显著高于对照组。腹腔注射组、经皮致敏组和灌胃致敏组血清IgA水平分别为12.92、12.65和12.13 μg/mL，但差异不显著。腹腔致敏组小鼠IgG、总IgE和小麦特异性IgE水平显著高于经皮致敏组和灌胃致敏组。各致敏组血清组胺含量（73.40、93.00、95.75 μg/mL）均显著高于对照组（12.15 μg/mL），且腹腔致敏组血清组胺含量最高。

A：血清IgA含量；B：血清IgG含量；C：血清总IgE含量；D：血清小麦特异性IgE含量测定；E：血清组胺含量。

图2 血清中抗体和组胺含量

血清细胞因子检测

采用悬浮芯片法对细胞因子进行检测。在三种致敏方式中，口服致敏小鼠Th1型抗体（IFN-γ，IL-2）含量高于经皮致敏和腹腔注射致敏组（图3A，B）。但腹腔注射致敏小鼠Th2型细胞因子（IL-4，IL-5和IL-13）的表达水平要高于经皮致敏组和口服致敏组（图3C-E）。致敏组与对照组小鼠IL-6的表达量差异并不显著。腹腔注射组小鼠Th17型细胞因子IL-17A的表达量与对照组存在显著差异。致敏组与对照组小鼠血清中Treg型细胞因子IL-10的含量差异显著。与Th2型细胞因子相似，腹腔注射组小鼠IL-6，IL-17A和IL-10的表达量要高于口腔致敏组和经皮致敏组。

A：血清中IFN-γ浓度；B：血清中IL-2浓度; C：血清中IL-4浓度；D：血清中IL-5浓度；E：血清中IL-13浓度；F：血清中IL-6浓度；G：血清中IL-17A浓度；H：血清中IL-10浓度。

图3 血清中细胞因子含量

肠道菌群结构与相对丰度分析

在门水平占据主导地位的主要包括厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和脱硫菌门（Desulfobacterota），在对照组和致敏组中均占门总数的70%以上（图4A，C）。肠道菌群优势属为另枝菌属（Alistipes）、毛螺菌科NK4A136组（Lachnospiraceae_NK4A136_group）和布劳特氏菌属（Blautia），其次为大肠杆菌属（Colidextribacter）、拟杆菌属（Bacteroides）和别普雷菌属（Alloprevotella）（图4B，D）。

A：门水平上菌群相对丰度；B：属水平上菌群相对丰度；C：门水平上菌群相对丰度；D：属水平上菌群相对丰度。

图4 在门和属水平上的肠道菌群相对丰度

肠道菌群多样性分析

从表1可知，各组小鼠肠道内容物高通量测序的有效数据分别为55515±4262、61827±4123、57352±4489和60268±3105。以97%的一致性OTUs聚类结果显示，每组的OTU数量分别为849±79.69、629±96、722±84和779±126。致敏组小鼠肠道内容物α-多样性指数均有所降低。对照组的shannon指数显著高于三个致敏组，chao1和ACE指数也显著高于经皮致敏组和腹腔注射致敏组，但与灌胃致敏组没有显著性差异。此外，腹腔致敏组与灌胃致敏组小鼠肠道菌群的物种组成最相似，其次与经皮致敏小鼠类似，与对照组小鼠相比致敏组肠道菌群组成差异较大（图5）。

表1 肠道菌群多样性指数表

图5 肠道菌群门水平树形图

肠道菌群LEfSe分析

进化分枝图中，由内至外的圆圈代表从门至属（种）水平的所有微生物区系结构（图6A）。LDA评分大于4的菌即为各组间统计学上显著差异类群（图6B）。在门水平上，对照组小鼠肠道菌群差异生物标记菌种为厚壁菌和拟杆菌门，而腹腔注射致敏组生物标记菌种为脱硫菌门，经皮致敏组小鼠为变形菌和厚壁菌门，口服致敏组则为拟杆菌门。

A：肠道菌群类群图；B：LDA评分直方图（LDA评分＞4）。

图6 肠道菌群的鉴定

Conclusion

灌胃致敏、经皮致敏和腹腔致敏均能不同程度引发小鼠过敏症状和肠道菌群失调。其中，腹腔注射致敏能显著促进小鼠血清特异性IgE、IgG、IgA及组胺水平升高，诱导Th2型炎性细胞因子水平显著升高，抑制Th1型抗炎细胞因子水平。小麦致敏显著降低小鼠肠道厚壁菌门相对丰度，并显著降低拟杆菌门相对丰度。具体而言，毛螺菌科（Lachnospiraceae）和颤螺菌科（Oscillospiraceae）的相对丰度升高，乳酸菌科丰度降低。在属水平上，另枝菌属（Alistipes）和拟杆菌属（Bacteroides）丰度增加，拟杆菌属毛螺菌科NK4A136（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、大肠杆菌（Colidextribacter）、链球菌属（Streptococcus）罗姆布茨菌（Romboutsia）、土杆菌（Turicibacter）和乳杆菌（Lactobacillus）丰度降低，且乳杆菌（Lactobacillus）是对照组的差异标记菌。

第一作者

刘成龙，男，中国农业大学食品科学与营养工程学院2018级博士研究生，研究方向食物过敏与肠道菌群。参与了“十三五”国家重点研发计划的相关研究工作。发表论文多篇，申请国家发明专利一项。

通信作者

薛文通，男，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授，博士生导师，中国农业大学中日食品研究中心主任，农业农村部农产品加工业专家委员会委员，农业农村部农产品加标准化技术委员会粮食加工技术委员会委员，中国农业工程学会农产品加工贮藏分会副理事长，中国食品和包装机械工业学会中央厨房工程与装备委员会副会长，中国农业机械学会农产品加工机械分会副主任委员，北京农业工程学会农产品加工贮藏分会会长。近年来主要研究食物致敏原确证技术及膳食成分对人体致敏机制影响；益生菌及其代谢产物对机体免疫应答规律等。共主持国家重点研发计划项目1项（食物过敏标识的风险评估技术研究），国家重点研发计划子课题1项，国家自然科学基金面上项目5项，国家科技支撑计划项目2项，国际合作项目2项，其他省部级研究项目19项。出版《主要食物过敏原致敏机理的研究》等著作14部。授权国家发明专利8项。获省部级及以上奖励5项。在国内外学术期刊发表论文240余篇。

Assessment of immune responses and intestinal flora in BALB/c mice model of wheat food allergy via different sensitization methods

Chenglong Liu, Chen Chen, Xingyu Yan, Shimin Gu, Xin Jia, Wenhui Fu, Xiao Meng, Wentong Xue*

College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

*Corresponding author.

Abstract

Increasing incidences showed that food allergies have attracted more and more attention from researchers. BALB/c mice were sensitized with wheat gluten combined with aluminum hydroxide adjuvant via intraperitoneal injection, transdermal sensitization, and oral gavage sensitization route. Results showed that all the three sensitization methods could induce allergic symptoms; increase the serum antibody (total immunoglobulin E (IgE), specific IgE, IgG, IgA) and histamine content; promote the secretion of Th2 cytokines (interleukin (IL)-4, IL-5, IL-13) and inflammatory factors (IL-6, IL-17A, IL-10); and inhibit the production of Th1 cytokines (IFN-γ, IL-2). However, the allergic symptoms of mice sensitized by intraperitoneal injection were the most obvious among the three models. The level of serum antibodies in intraperitoneal injection group was significantly higher than control. Subsequently, 16S rRNA sequencing technology was used to analyze the intestinal flora of mice. The results showed that the abundance of Firmicutes in the wheat protein sensitized group was lower than that in the normal group, while the abundance of Bacteroidetes was higher, and Lactobacillus was the difference marker in normal group. Bacterial species diversity analysis showed that the species richness and diversity of intestinal flora in mice were decreased, the difference between mice induced by intraperitoneal injection and normal control group mice was the most significant. Taken together, these results show that among three sensitization methods used to build a mouse model with aluminum hydroxide as adjuvant, intraperitoneal injection is the comparably best way to build a mouse sensitization mode.

Reference:

LIU C L, CHEN C, YAN X Y, et al. Assessment of immune responses and intestinal flora in BALB/c mice model of wheat food allergy via different sensitization methods[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 871-881. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.016.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅