食品界

华南理工大学食品科学与工程学院周非白副研究员等：基于配位作用的铁-大豆蛋白纳米复合物制备及性质

铁是人体维持正常生理功能所必需的矿质营养元素，参与氧气运输、细胞增殖分化、电子转移、能量代谢等重要生理过程。人体缺铁易导致缺铁性贫血（IDA）。日常膳食中铁摄入量不足是缺铁的主要原因。因此，对食品进行铁营养强化是预防和改善IDA的有效途径。

传统铁营养强化剂的应用难题在于生物利用度和稳定性不能兼顾，这限制了铁强化食品中的铁添加量。研究发现，蛋白可以作为配体与Fe2＋等金属离子结合形成稳定分散的复合物，表现出良好的矿物质递送潜力，引起人们关注。

华南理工大学食品科学与工程学院詹宏栋、周非白*等研究以大豆分离蛋白（SPI）为原料，对其进行碱热处理后，引入Fe^2＋以制备铁-大豆蛋白纳米复合物，优化复合物的制备条件，研究其结构特点并进一步探究其中铁的反应活性和胃肠消化特性，旨在为新型植物蛋白基铁递送体系的构建提供理论指导。

1 铁-大豆蛋白纳米复合物的制备条件

如图1A所示，Fe^2＋浓度为1～2.5 mmol/L时，样品能在pH 7下保持稳定分散并且呈浅黄色，表明HSPI_pH7可作为配体与Fe^2＋通过配位键结合，从而避免了游离铁在中性条件下水解沉淀；而当Fe^2＋浓度达到5 mmol/L时体系中出现大量沉淀。由图1A可知，HSPI_pH7本身的平均粒径较大（大于120 nm）而均一性较差（PDI＞0.3）；引入适当浓度的Fe^2＋（1～2.5 mmol/L）可形成平均粒径较小（＜80 nm）且分布均匀（PDI约为0.2）的纳米复合物。粒径的降低可能与加入Fe^2＋后蛋白肽链进一步折叠有关。

如图1B所示，随着反应pH值从7.0逐渐增加到12.0，样品始终保持稳定分散的状态，但是颜色逐渐加深。反应pH值为8.0～12.0时，样品PDI均大于0.3，表明在碱性条件下制备的纳米复合物均一性较差。进一步通过透射电子显微镜观察HSPI及不同pH值下制备的复合物微观形貌，如图2所示。HSPI_pH7尺度较大且各组分大小不一；Fe-HSPI_pH7、Fe-HSPIp_H10、Fe -HSPI_pH12呈尺度较小的颗粒状形态，其中以Fe-HSPI_pH7的均一性最好，与其较低的PDI相对应。透射电子显微镜观察得到的形貌尺寸均小于DLS测定结果。

上述结果表明，在中性至碱性条件下HSPI均能与适当浓度Fe^2＋反应得到稳定分散的纳米复合物，但其颜色和均一性受pH值影响；其中，中性条件下制备的纳米复合物颜色较浅、均一性最好。‘

2 荧光光谱分析

蛋白中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸具有荧光特性，通过蛋白内源荧光的变化可以观察这3 类疏水氨基酸所处微环境的变化。如图3A所示，随着Fe^2＋浓度提高，荧光强度逐渐降低，其原因可能是Fe^2＋引起蛋白肽链发生折叠，使这3 类疏水氨基酸所处微环境极性增加。

如图3B所示，不同pH值下制备的样品的荧光强度不同，反应pH值越高，峰值荧光强度越大，可见不同pH值下Fe^2＋对大豆蛋白结构的影响程度不同，其原因可能为更高pH值的环境可以促进与HSPI结合的Fe^2＋转化为氢氧化物，从而影响了铁与蛋白的相互作用。上述结果表明Fe^2＋可以诱导蛋白结构发生变化，使其荧光强度降低，其效果受Fe^2＋浓度和反应pH值影响。

3 体外模拟胃肠消化分析

如图4A所示，消化前，所有样品都保持较低的游离铁含量，可见其中大部分铁都处于与蛋白结合的状态，其中碱性条件（pH 10、12）下制备的样品具有更低的游离铁含量，表明不同pH值下HSPI与铁反应的能力不同。经胃消化后，3 个样品都释放了少量游离铁；而经过进一步肠消化后游离铁含量相比胃消化阶段有所降低。

如图4B所示，样品消化前可溶性铁含量超过90%，说明不同pH值制备的纳米复合物在中性条件下都具有较好的铁溶解性。经胃肠消化后，所有样品的可溶性铁含量略有下降，但仍超过60%，表明具有较高的吸收利用潜力。结合图4A可知，所有样品经胃肠消化后游离铁含量均低于20%，远低于可溶性铁含量。所有样品中Fe-HSPI_pH7经消化后的可溶性铁含量最高（＞80%），表明其消化稳定性最好。

根据上述结果，不同pH值制备的Fe-HSPI中，Fe-HSPI_pH7的颜色较浅，且具有最好的均一性和吸收利用潜力，与其他样品相比具备更高的应用价值，因此选择Fe-HSPI_pH7为样品进一步分析其结构和应用效果。

4 FTIR分析

如图5所示，与Fe^2＋结合后，HSPI_pH7位于1641 cm^－1处因C＝O的伸缩振动产生的酰胺I带吸收峰偏移至1645 cm^－1和1651 cm^－1，1399 cm^－1处—COO—对应的吸收峰偏移至1402 cm^－1。此外，Fe-HSPI_pH7在1142 cm^－1处出现了更强的吸收峰，对应C—O键的伸缩振动，表明可能形成了C—O—Fe结构。HSPI_pH7位于2874 cm^－1和2933 cm^－1两处的吸收峰在Fe-HSPI_pH7中分别偏移至2877 cm^－1和2934 cm^－1。综上，Fe^2＋与SPI的主要结合位点可能为氨基和羧基，可能因为这些基团中存在氧和氮等具有孤电子对的原子，可以与铁形成配位键。

5 内部作用力分析

如图6所示，经尿素处理的样品外观及游离铁含量均无明显变化，表明氢键在复合物中的作用较小；在SDS溶液及其与尿素的混合溶液中外观无明显变化而游离铁含量略有下降，表明疏水相互作用对复合物结构影响较小，但SDS可能会结合少部分游离铁；而当体系中存在DTT时出现了明显的灰绿色沉淀，并且游离铁含量从约20%提升至约40%。综上，疏水相互作用和氢键对铁-大豆蛋白纳米复合物的形成贡献较小，而二硫键是维持蛋白与铁结合的关键作用力。

6 乳液脂质氧化分析

如图7A所示，4 周内所有乳液的POV都快速增加，其中添加了FeSO₄乳液的POV达到了空白乳液的2 倍，表明FeSO₄具有较强的催化脂质氧化的活性；而添加Fe-HSPI_pH7乳液的POV约为FeSO₄乳液的80%，表明其中铁的反应活性有所降低。此外，对于只添加HSPI_pH7的乳液，其POV与空白乳液相近，可以认为HSPI_pH7对乳液脂质氧化的影响较小。

如图7B所示，经过4 周的贮存，空白乳液和HSPI乳液的TBARS值几乎为0，表明其中未检测出次级氧化产物MDA；FeSO₄乳液的TBARS值迅速增加至0.18 mmol/mL，而Fe-HSPI_pH7乳液的TBARS值仅为FeSO₄乳液的三分之一，可见Fe-HSPI_pH7催化脂质氧化的能力相比FeSO₄明显降低。添加HSPI的乳液的POV和TBARS值均与空白乳液相近，说明HSPI本身不能抑制脂质氧化，由此推测铁的反应活性降低的主要原因很可能是HSPI_pH7与铁的结合作用使铁的反应活性降低。HSPI_pH7可能限制了铁在体系中的自由移动，使其不能与油相充分反应。虽然Fe-HSPI_pH7中铁的反应活性有所降低，但在乳液中引起的脂质氧化效应并未完全消除，可能是因为体系中仍有部分的游离铁。

7 结论

大豆蛋白经碱热预处理后，可与适当浓度的FeSO₄（2.5 mmol/L）反应形成稳定分散的纳米复合物（Fe-HSPI），该过程受反应pH值调控。不同pH值下制备的Fe-HSPI经模拟胃肠消化后都能保持蛋白与铁的结合，具有较好的消化稳定性，其中在pH 7下制备的纳米复合物（Fe-HSPI_pH7）均一性较好（PDI＜0.2），且消化后的可溶性铁含量超过80%，具备良好的吸收利用潜力。铁与HSPI结合可引起其肽链进一步折叠形成通过二硫键维持稳定的结构，主要结合位点为氨基的氮原子和羧基的氧原子。与FeSO₄相比，Fe-HSPI_pH7在水包油乳液中引起的脂质氧化程度显著降低，表现出更低的反应活性，具有更好的应用潜力。本研究的结果可为新型植物蛋白基铁递送体系以预防和改善IDA提供一定理论和方法的指导。