长沙理工大学食品与生物工程学院王发祥副教授等：壳聚糖复合保鲜对冷藏草鱼肌肉蛋白质组的影响
2023-07-14作者：来源：责任编辑：食品界
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草鱼为我国的“四大家鱼”之一，其生长迅速、肉质鲜美、价格低廉，是我国重要的淡水养殖鱼类，其营养丰富，富含蛋白质、不饱和脂肪酸以及人体必需的微量元素，是一种优质的动物蛋白资源，深受消费者喜爱。然而，由于其水分含量和内源性蛋白酶活性高、pH值中性等特点，在加工、贮运、销售过程中极易发生腐败变质。蛋白质为肌肉组织的最重要组成成分，其数量和完整性直接决定了鱼肉品质。因此，分析壳聚糖复合保鲜处理对草鱼肌肉蛋白质组变化的影响，不仅能从蛋白质组学角度阐释壳聚糖复合保鲜剂对草鱼的保鲜机制，也有助于了解草鱼腐败过程的肌肉蛋白质变化细节和明确关键指示蛋白。
为了进一步明确草鱼冷藏过程中发生变化的关键蛋白质种类及保鲜处理对其变化规律的影响，长沙理工大学学食品与生物工程学院李嘉蕾、陈赛、王发祥*等基于采用双向电泳-质谱（2DE-MS）技术分析保鲜和未保鲜草鱼样品肌肉蛋白质组的差异，为探究鱼肉腐败过程中肌肉蛋白质的变化模式及壳聚糖复合保鲜对草鱼蛋白质变化的影响机制提供生物学依据。
1 草鱼肌肉蛋白质2-DE图谱的变化分析
课题组前期研究表明，壳聚糖复合保鲜能显著抑制草鱼冷藏过程中鲜度（K值）、挥发性盐基氮含量、汁液流失率、质构等品质特性的变化，有效延缓了鱼肉的品质劣变进程；体积排阻色谱和SDS-PAGE分析发现，保鲜与未保鲜草鱼样品肌肉蛋白质分子质量分布和亚基组成发生显著变化的关键时间点为冷藏第9天，因此选择冷藏第9天的草鱼样品进行差异蛋白质组学分析。 将第0天（鲜样）和冷藏第9天（对照、保鲜组）的草鱼肌肉蛋白质样品进行2-DE分析，获得2DE图谱，如图1所示，保鲜组草鱼冷藏第9天时肌肉蛋白质的变化较小，而对照组与新鲜组相比，图谱上蛋白点数量（信号）明显增加，同时也伴随着部分蛋白点消失，说明对照组草鱼冷藏第9天时肌肉蛋白质的变化较大。利用Image Master 2D软件对图谱进行分析，新鲜组图谱中检测出347 个蛋白点，第9天保鲜组图谱检测出359 个蛋白点，与新鲜组相比仅增加了12 个；而第9天对照组检测出的蛋白点数目达543 个，与新鲜组相比增加了196 个。说明草鱼冷藏过程中肌肉蛋白质的种类和数量均发生了很大变化，而壳聚糖复合保鲜能较好地维持肌肉蛋白质的稳定，保鲜效果明显。 将3 组样品的2-DE图谱两两对比，对蛋白丰度表达差异较大的蛋白点进行标记，以两组间蛋白点的相对丰度比值大于2为差异表达蛋白点。分析结果表明，第9天保鲜组与新鲜样品间差异蛋白点共27 个。与新鲜样品相比，第9天保鲜组丰度下调的蛋白点16 个，将其编号为A01～A16；丰度上调的蛋白点11 个，编号为B01～B11。通过进一步重复性和匹配性检测，筛选出4 个典型差异蛋白点（A08、A14、B10、B11）进一步分析，比对结果如图2所示。 在第9天，保鲜组与对照组样品差异蛋白点共20 个，与对照组样品相比，保鲜组丰度上调的蛋白点15 个，编号为C01～C15；丰度下调的蛋白点5 个，编号为D01～D05。通过进一步重复性和匹配性检测，筛选出8 个典型差异蛋白点（C12、C13、C14、C15、D01、D02、D04、D05）进一步分析，比对结果如图3所示。
新鲜组与第9天对照组样品差异蛋白点共27 个，与新鲜样品相比，第9天对照组样品丰度下调的蛋白点19 个，编号为E01～E19；丰度上调的蛋白点8 个，编号为F01～F08。通过进一步重复性和匹配性检测，筛选出14 个典型差异蛋白点（E01、E05、E07、E16～E19、F01～F04、F06～F08）进一步进行质谱鉴定，差异蛋白点比对如图4所。
将上述26 个典型差异蛋白点进一步进行质谱分析，其中A14和E16、B11和C15、D01和F02、D02和F03、D05和F06为图谱中重复点，故实际切胶回收差异蛋白点共计21 个。通过对这些差异蛋白点进行MALDI TOF/TOF MS分析，最终成功鉴定出20 个蛋白点。其中，A08鉴定失败，A14、C14和E19，B11和C12，C13、E17和E18分别同源且为肌钙蛋白T的3 种异构体，F01和F02、F04和F08为同源蛋白质，故20 个蛋白点共鉴定出11 种蛋白质，鉴定结果如表1所示。
由表1可见，鉴定出的11 种关键蛋白质主要为肌肉结构蛋白质和某些关键代谢酶。结合图2～4可知，冷藏第9天的保鲜组样品与新鲜草鱼样品的差异蛋白质主要为肌钙蛋白T（troponin T，Tn-T）和腺苷酸激酶同工酶1（adenylate kinase isoenzyme 1）；肌钙蛋白T具有5 种异构体，2 种来自慢收缩肌肉，即慢肌钙蛋白T（Tn-T 1S和Tn-T 2S），3 种来自快收缩肌肉，即快肌钙蛋白T（Tn-T 1F、Tn-T 2F和Tn-T 3F）；根据表1中Tn-T分子质量和等电点特征，蛋白点B11、C12为Tn-T 1S（分子质量32 kDa，酸性），C13、E17、E18和A14、C14、E19分别为Tn-T 2F和Tn-T 3F。结合图2可知，冷藏过程中，保鲜组快肌钙蛋白T丰度下降，而慢肌钙蛋白T丰度上升。相对而言，对照组草鱼冷藏第9天肌肉蛋白质组变化较大，主要表现在快肌钙蛋白T（Tn-T 2F、Tn-T 3F）、原肌球调节蛋白4、突触足蛋白2、M型丙酮酸激酶的丰度下调，这些下调的蛋白多为一些调节蛋白和糖酵解关键酶，表明未保鲜样品冷藏过程中肌肉组织活力和代谢减弱；肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1、α-肌动蛋白、α-原肌球蛋白、轻酶解肌球蛋白等结构蛋白的丰度上升，这些蛋白主要来源于肌球蛋白和肌动蛋白，它们在肌原纤维中通常以不溶于水的复合体形式存在。因此，蛋白丰度上调可能是因为鱼肉样品的肌原纤维蛋白发生解聚和降解。
此外，与冷藏第9天保鲜组草鱼样品相比，未保鲜对照样品中典型差异蛋白质的变化主要表现在3 种肌钙蛋白T丰度均下调，肌球蛋白重链、轻酶解肌球蛋白、α-肌动蛋白、α-原肌球蛋白等主要肌原纤维蛋白的丰度上升。这说明与未保鲜对照相比，保鲜组草鱼肌肉蛋白质变化程度较低，壳聚糖复合保鲜较好地维持了草鱼冷藏过程中肌肉蛋白质的稳定。此外，在第9天，对比鲜样，对照组样品中M型肌酸激酶（蛋白点D04）的丰度较高。肌酸激酶丰度上升是鱼肌肉组织受损的标志，可以将其作为草鱼腐败的指示蛋白。 壳聚糖复合保鲜能明显抑制草鱼肌肉蛋白质组在冷藏过程中的变化。与鲜样相比，保鲜组草鱼肌肉中快肌钙蛋白T丰度下降，而慢肌钙蛋白T和腺苷酸激酶同工酶1丰度上升；对照组草鱼肌肉中快肌钙蛋白T、原肌球调节蛋白4、突触足蛋白2、M型丙酮酸激酶的丰度下调，而肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、α-肌动蛋白、α-原肌球蛋白、轻酶解肌球蛋白等结构蛋白的丰度上升。对照组与保鲜组相比，典型差异蛋白质主要表现在3 种肌钙蛋白T丰度下调，而肌球蛋白重链、轻酶解肌球蛋白、α-肌动蛋白、α-原肌球蛋白、M型肌酸激酶的丰度上升，其中肌酸激酶可作为检测草鱼腐败的指示蛋白。
本文《壳聚糖复合保鲜对冷藏草鱼肌肉蛋白质组的影响》来源于《食品科学》2023年44卷09期147-153页.作者：李嘉蕾，陈赛，田明礼，俞健，刘永乐，王发祥. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220331-394.
