食品界

FSHW | 豌豆蛋白的物理特性和乳化性能：亚麻籽胶物理改性联合超声处理的影响

Introduction

豌豆蛋白（PP）具有很高的营养价值，能为人体提供各种必需氨基酸，是一种极具潜力的动物蛋白替代品。物理超声处理可通过减小蛋白质尺寸、提高表面疏水性和分子流动性改善蛋白质的乳化性能。然而，超声波会促进蛋白质的变性，降低蛋白质的热稳定性。蛋白质与多糖的物理相互作用可以作为乳化剂改善蛋白质的乳化能力、热稳定性、油溶性和掩盖其口感。因此，本研究通过物理超声与蛋白质-多糖复合改性相结合来增强PP的热稳定性和乳化性能，将开拓蛋白质的应用领域。

亚麻籽胶（FG）是一种阴离子杂多糖，具有良好的增稠性、起泡性、乳化性、凝胶性和持水性等特性。阴离子多糖可与蛋白质形成复合物，降低蛋白质表面疏水性，提高乳化性。超声波刺激蛋白质内部疏水基团的暴露，改变二级结构，导致蛋白质的物理和功能特性发生变化，此外，超声波可通过机械和空化效应对多糖进行物理降解，从而有效提高多糖的溶解性。因此，本实验的目的是研究物理超声和FG相互作用对PP组成、粒径、浊度、ζ-电位、表面疏水性、固有荧光、界面张力、热稳定性和流变特性的影响，并与天然PP进行比较。此外，通过乳化活性指数（EAI）、乳化稳定性指数（ESI）、乳滴粒径、ζ-电位、微观结构和贮藏稳定性等方面对天然PP及其改性蛋白制备的亚麻籽水包油乳液的乳化性能进行评价。这项工作提供了关于FG混合和超声波联合改性PP的物理和乳化特性的有价值的信息，扩大了植物蛋白作为优良乳化剂在食品工业中的广泛应用。

Results and Discussion

FG的单糖组成

提取的FG中的单糖包括鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖，其中木糖含量最高，阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖分别为15.84%、14.83%和10.08%。岩藻糖、鼠李糖和半乳糖醛酸三种酸性单糖的总含量为23.92%，使水溶液中的FG带负电荷。

表1 FG中单糖组成的摩尔百分比

FG和超声对PP蛋白质组成和红外光谱的影响

PP由豆球蛋白（11S）和豌豆球蛋白（V）组成，11S是一种六聚体蛋白，V是一个7S三聚体蛋白。SDS-PAGE结果显示（图1A），四种蛋白质溶液的组分相似，表明超声和FG处理不影响PP的亚基组成和结构。与PP相比，超声处理或附加FG均未检测到额外的条带。因此，FG和超声对PP的作用属于物理改性。

四种蛋白样品冻干粉的FTIR光谱如图1B。在1649～1650.93 cm⁻¹和1548.71 cm⁻¹处有两个特征峰，分别与酰胺I区的C＝O拉伸振动、酰胺II区的C-N拉伸振动和N-H弯曲振动有关。当FG与PP结合时，在1649 cm⁻¹处的特征峰发生转移，可能是由于分子疏水和氢键相互作用导致官能团结构变化。此外，3200～3500 cm⁻¹是由于羟基和氨基拉伸振动的重叠。因此，PP和FG是物理结合相互作用。

图1 （A）基于SDS-PAGE的还原条件下PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液的蛋白组成模式，（B）冷冻干燥PP、PPU、PPFG和PPFGU粉末的FTIR

FG和超声对粒径分布和PPζ-电位的影响

PP、PPU、PPFG、PPFGU的粒径分布（D_z）和ζ-电位如图2所示。与PP和PPFG溶液相比，PPU和PPFGU溶液的D_z分别从285 nm降低到226 nm和905 nm降低到788 nm。是由于超声的空化效应产生湍流和高剪切力，使蛋白质分子裂解为小分子。加入FG后，尺寸较大的PP所占比例较大。ζ-电位值越高，表明静电斥力越大，与可溶性蛋白质颗粒形成的胶体系统更稳定。因此，PPFGU表现出最佳形成稳定胶体系统的能力。与PPFG溶液相比，PPFGU的ζ-电位无显著变化，可能是因为超声处理后FG与PP相互作用，对PP产生静电屏蔽效应。综上，FG与PP的复合物以及超声的空化效应使PP的粒径减小，ζ-电位值增大。

图2 PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液的粒径分布（A）和ζ-电位（B）

FG和超声波对PP浊度的影响

超声显著降低PP的浊度，而FG增加PP的浊度。4种蛋白溶液的浊度大小顺序为PPU＜PP＜PPFGU＜PPFG。四种蛋白溶液的外观差异与浊度值相同（图3）。因此说明超声使蛋白粒径减小，而FG与PP相互作用，形成可溶性更大的复合物，导致浊度增大。

图3 PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液的浊度

FG和超声波对PP疏水性能的影响

在pH 7.0时，PP、PPU、PPFG和PPFGU的荧光强度如图4A所示。与PP相比，PPFG、PPU和PPFGU的荧光峰强度增强，表明超声和FG促进PP色氨酸残基的暴露。此外，在相同pH下，PPFGU的荧光强度高于PPFG溶液，说明PPFGU暴露出更多的内部疏水基团。PPFG和PPFGU溶液的荧光强度从pH 2.0到pH 7.0显著增加，在pH 7.0～10.0趋于稳定。表明超声处理下PP与FG的相互作用增强。

表面疏水性能H0为PP＜PPFG＜PPFGU＜PPU（图4B）。超声处理增加PPU和PPFGU的H0，是由于高强度的冲击波、剪切力和湍流引起的，触发隐藏在蛋白质分子中的疏水残基的暴露。此外，FG的加入提高PP的H₀。结果表明，FG和超声促进了PP的结构变化和疏水性氨基酸的暴露。

图4 pH 7.0时PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液的内源荧光（A）和表面疏水性（B）

FG和超声对DIFT的影响

pH 7.0时亚麻籽油-蛋白质溶液界面的DIFT如图5所示。与PBS溶液相比，4种PP溶液中的蛋白质均能吸附到油/水界面，在DIFT曲线上表现出两种不同阶段。超声波促进蛋白质（PPU）的吸附能力，初始界面张力（9.96 mN/m）在第一阶段比PP下降更快。超声波可以减小蛋白质颗粒尺寸，刺激蛋白质分子展开，使PP更容易吸附到油水界面（图2A）。与PP和PPU相比，FG的加入显著提高初始界面张力（约为11.83 mN/m）。可能是由于溶液黏度的增加或FG和PP之间的竞争吸附作用对PP的吸附产生屏蔽作用。因此，超声处理有效增强PP与FG的相互作用，加速PP-FG复合物吸附在界面上；显著降低DIFT，且降低速率明显加快，有利于产生更小的液滴和更好的乳液稳定性。

图5 样品与PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液在亚麻籽油/水界面的DIFT

FG和超声处理对PP流变性能的影响

与PPFG和PPFGU相比，PP和PPU的黏度较低（图6A）。FG具有增稠和胶凝特性，可以显著提高蛋白质溶液的黏度。由于超声剪切作用的影响，PPFGU的黏度较PPFG有所下降。对于蛋白溶液的黏弹性，四种溶液的G'均高于G''（图6B），表明其主凝胶特性较弱。FG显著增加了G'而超声降低了G'。此外，在测试频率下，PPFG和PPFGU的tanδ均小于1。表明PP和PPU在低频下表现出液态行为，而PPFG和PPFGU在任何测试频率下均表现出类固态行为。总之，较小的黏度、良好的类固体网络结构和较小的粒径会使PPFGU表现出更好的乳化能力。因此，超声处理是提高PP乳化性能的有效途径。

图6 （A）PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液黏度随剪切速率、（B）PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液的储能模量（G'，实线）和损耗模量（G''，虚线）随频率的变化

FG和超声处理对PP热性能的影响

与PP和PPFG相比，超声显著降低了PPU和PPFGU的T_peak。PPFGU的T_peak略低于PP，PPFGU的T_peak高于PPU，说明FG具有提高蛋白质热稳定性的作用。此外，PPFG和PPFGU的热流曲线斜率变化慢于PP和PPU，表明FG减缓了PP的变性。超声促进蛋白质的聚集，需要更多的热量使PPU的聚集体变性。添加FG后，PPFG和PPFGU的ΔH较未添加FG的PP明显提高。综上所述，FG的加入促进T_peak较高的PP的热稳定性，超声和FG的联合作用可以降低蛋白质的变性速度，均有利于蛋白质的热稳定性。

表2 PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液的蛋白质变性温度（T_peak）和变性焓（ΔH）

FG和超声处理对PP乳化性能的影响

如图7A-B所示。粗乳液的EAI顺序为PP＜PPU＜PPFG＜PPFGU，ESI大小顺序为PPFGU＞PPU＞PP＞PPFG。PPFG粗乳液的稳定性很差（图7B）。可能是在pH 7.0的温和磁力搅拌下带负电荷的FG与PP不相容，导致出现两相。然而，超声处理后PPFG粗乳液的稳定性显著提高，表现出最高的ESI，没有明显的相分离，证实超声促进PP与FG的更强结合，增强PP-FG复合物的稳定性，从而改善PP的乳化性能。

乳液的液滴大小为PP乳液＞PPU乳液≥PPFG乳液＞PPFGU乳液（图7C），与显微照片中液滴的大小和分散情况一致（图7E）。超声处理不影响乳液的ζ-电位，而FG显著提高乳液的ζ-电位（图7D）。在4 °C贮藏18 d后，PP乳液在乳液顶部出现乳析，36 d后出现释油和水沉现象（图7F）。贮藏42 d后，PPU和PPFG乳液均出现水沉降现象，而PPFGU乳液依然稳定。

此外，未经处理的聚集体内部的疏水蛋白残基通过超声进一步暴露，导致疏水性增加，改善液滴界面的界面堆积。FG具有胶凝和乳化的能力，可以限制油水分离和沉降的流动性。PPFGU乳液表现出最好的储存稳定性，表明超声和FG的协同作用增强乳液的稳定性。

图7 PP、PPU、PPFG和PPFGU溶液的EAI（A）、ESI（B）粒径（C）、ζ-电位（D）

本研究的发现总结于图8。超声减小粒径，增加蛋白质乳化剂吸附在界面上的能力，使其具有更少的能量和更高的表面积覆盖率，从而提高乳化性能。PP和FG在PBS中显示互溶性，为同类型的亲水胶体。当连续相中FG含量较高时，在贮藏期间出现耗竭絮凝现象，因此PPFG稳定的粗乳液发生相分离（图7B）。与PPFG粗乳液相比，PPFGU粗乳液表现出更好的稳定性，而且PPFGU较小的蛋白质颗粒表现出更好的吸附到油水界面的能力，在防止液滴絮凝方面获得了比PP更高的ζ-电位和更厚的膜（图7F）。总之，本研究结果表明，FG混合和超声处理两种温和的物理改性方法相结合，有效改善了PP的物理性能，尤其是作为乳化剂的乳化能力，可在食品工业中广泛应用。

图8 PBS溶液和乳液中粒子结构假设的图解

Conclusion

FG和超声处理通过分子间疏水和氢键的相互作用显著改善了PP的物理和乳化性能。PPFGU具有更大的粒径和浊度以及更高的ζ-电位。超声处理后，PP-FG复合物的粒径通过空化效应减小。PPFGU的本征荧光强度和H₀增强，导致界面张力下降，蛋白吸收率增加。超声和FG也降低了PP的变性速度，同时增加了溶液黏度。因此，PPFGU对乳化性能的改善效果最好。PPFGU稳定的亚麻籽水包油粗乳液具有最高的EAI，ESI。与PP、PPU和PPFG稳定的乳液相比，PPFGU乳液在储存期间表现出最佳的稳定性。总之，超声波与阴离子多糖的结合可以显著提高植物蛋白的乳化性能，有助于其作为功能性乳化剂在食品工业中广泛应用。

Physical and emulsifying properties of pea protein: influence of combined physical modification by flaxseed gum and ultrasonic treatment

Jia Yang^a, Fenghong Huang^a, Qingde Huang^a, Da Ma^b, Yashu Chen^a, Dengfeng Peng^a, Xiao Yu^a,c, Qianchun Deng^a,*, Fang Geng^d,*

^a Oil Crops Research Institute, Hubei Key Laboratory of Lipid Chemistry and Nutrition, and Key Laboratory of Oilseeds Processing, Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Science, Wuhan 430062, China

^b College of Packaging Engineering, Jinan University, Zhuhai 519070, China

^cCollege of Food and Biological Engineering, Henan Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety, Henan Key Laboratory of Cold Chain Food Quality and Safety Control, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China

^dKey Laboratory of Coarse Cereal Processing (Ministry of Agriculture and Rural Affairs), School of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China

*Corresponding author.

Abstract

This study characterized and compared the physical and emulsifying properties of pea protein (PP) and its modified proteins (ultrasound treated- PP (PPU), flaxseed gum (FG) treated PP (PPFG) and ultrasound treated- PPFG (PPFGU)). The results showed FG triggered the formation of loosely attached complex with PP via physical modification under gentle magnetic stirring at pH 7.0, while ultrasound played an important role in reducing protein size, increasing surface hydrophobicity and molecular fluidity onto oil-water interface. So ultrasound further enhanced the interaction of PP with FG, and produced the PPFGU complex with smaller droplet size, higher ζ-potential and lower turbidity. Further, combination of FG and ultrasound improved the physical properties of PP with higher viscosity, stiffer gels (defined as higher elastic modulus), stronger hydrophobic properties, better thermal stability, and fast protein absorption rate. Therefore, the PPFGU coarse emulsion performed highest emulsifying activity index (EAI) and emulsion stability index (ESI) that the stabilized nanoemulsion obtained smallest droplet size, higher ζ-potential, and longest storage stability. The combination of FG and ultrasonic treatment will be an effective approach to improving the emulsifying property and thermal stability of PP, which can be considered as a potential plant-based emulsifier applied in the food industry.

Reference:

YANG J, HUANG F H, HUANG Q D, et al. Physical and emulsifying properties of pea protein: influence of combined physical modification by flaxseed gum and ultrasonic treatment[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 431-441. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.045.