食品界

FSHW | 用无标记蛋白质组学方法研究驴和牛初乳乳清蛋白的差异表达

Introduction

初乳是哺乳动物在新生儿出生后立即通过乳腺产生的第一种乳汁。初乳含有可以保护新生儿免受疾病和感染的抗体，免疫、生长因子和其他生物活性化合物，有助于激活新生儿的免疫系统，启动肠道功能，并在生命的最初几天培育健康的肠道微生物群。牛和人初乳的成分非常相似，包括许多相同的抗体、免疫和生长因子以及其他营养物质。牛初乳对人类健康有多种益处，包括支持免疫健康、消化健康、早期生命营养和运动营养。然而，牛乳也是导致婴儿过敏的最常见的食物过敏原之一。大约5%～15%的婴儿会经历由牛乳蛋白过敏引起的过敏反应，而且由于检测牛乳过敏的难度，这个发病率可能被低估。驴乳的蛋白质和乳糖含量与人乳相似，因此被认为是理想的替代品。此外，驴乳含有更多的乳清蛋白（约35%～50%），比牛乳（约20%）更多，这表明驴乳适合作为对牛乳蛋白过敏的婴儿的牛乳潜在替代品。

乳清蛋白是一种主要的乳蛋白，通过同源转移在新生哺乳动物的免疫防御中起着至关重要的作用。乳清蛋白主要包括α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶、免疫球蛋白和乳铁蛋白。驴乳的特点是酪蛋白含量低，与牛乳相比，其乳清/酪蛋白的比例几乎相当于人乳。这些特性被认为决定了驴乳和牛乳在过敏性和消化率方面的显著差异。此外，研究表明驴乳清蛋白具有一定的生理功能，如抗菌和抗癌特性。

与牛乳蛋白的特性相比，驴乳蛋白的研究相对较少，主要包括乳清、酪蛋白和乳脂球膜蛋白。利用蛋白质组学方法对驴酪蛋白进行了研究，包括一维和二维电泳、考马斯亮蓝或特定多克隆抗体染色以及结构质谱分析，最终观察到κ酪蛋白的11个组分，β和α_S1-酪蛋白的6个磷酸化组分，以及α_S2-酪蛋白的3个主要磷酸化组分。使用基于无标签的比较蛋白质组学方法从德州驴乳中鉴定了216种乳清蛋白，其中19种在高产乳样品中表现出显著差异。目前的研究多集中于驴乳蛋白质在不同物种间的比较，而对不同物种间牛乳蛋白质的比较，特别是驴初乳和牛初乳乳清蛋白的比较研究还很有限。

因此，本研究的目的是利用基于高效液相色谱-串联质谱仪（HPLC-MS/MS）的蛋白质组学方法对驴和牛初乳中的乳清蛋白进行鉴定和比较。本研究的进一步目标是在驴和牛初乳共同的蛋白质中鉴定差异表达的乳清蛋白，并研究它们之间的相互作用和相关的代谢途径。这一结果可能有助于更深入地了解乳清蛋白的组成，并为优化初乳产品，特别是将上述两种乳源混合开发婴儿配方乳粉提供理论依据。

Results

驴和牛初乳中乳清蛋白的特性

总共有933个乳清蛋白被定性（表S1），包括驴和牛初乳中分别有620和696个乳清蛋白。其中，383个常见的乳清蛋白（41.1%）在两组中都有发现。还发现了237个驴的特异性乳清蛋白（25.4%）和313个牛的特异性乳清蛋白（33.5%）（图A）。

驴和牛初乳中DEWPs的鉴定

确定的驴和牛初乳之间乳清蛋白的差异为DEWP的筛选奠定了基础。随后的分析集中在驴和牛初乳共有的383种常见乳清蛋白上，并试图从这些常见的乳清蛋白中筛选出DEWPs。因此，设定了一个阈值来筛选驴和牛初乳之间的DEWPs。在本研究中，以P＜0.05和折叠变化≥±1.50作为阈值。如图1和表1所示，在驴和牛初乳的383个常见乳清蛋白中，发现了80个DEWPs，包括驴初乳中21个上调和59个下调的DEWPs。

图1 （A）驴和牛初乳中已确定的乳清蛋白的维恩图。（B）驴和牛初乳中已确定的乳清蛋白的火山图。（C）驴和牛初乳中差异表达乳清蛋白的热图分析

DWP的GO分析

根据GO注释术语，驴和牛初乳之间的80个DEWPs被分为3个子成分（图2）：细胞成分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）。包含最多DEWPs的CC亚组包括胞外体、质膜、线粒体、细胞膜、膜、内质网、可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）附着蛋白受体复合物、脂质颗粒、焦点粘附和内质网膜。MF亚组包含三磷酸鸟苷（GTP）结合、GTP酶活性、可溶性NSF附着蛋白（SNAP）受体活性、参与细胞-细胞粘附的卡德林结合、蛋白质结合、SNARE结合、钙依赖性磷脂结合、二磷酸鸟苷结合、信号传导器活性和磷脂酶A2抑制剂活性。此外，最常见的BP术语有氧化还原过程、细胞间黏附、小GTP酶介导的信号转导、胆固醇生物合成过程、脂肪酸生物合成过程、囊泡融合的正调节、多巴胺受体信号通路、甘油三酯的隔离的正调节、突触小泡与突触前活动区膜的融合以及乳腺发育。

图2 驴和牛初乳差异表达乳清蛋白的GO注释

DEWPs的代谢途径分析

与DEWP相关的前20条主要代谢途径如图3所示。与此相关的信号通路依次为：脂肪酸生物合成、雌激素信号通路、弓形虫病和恰加斯病（美国锥虫病）、血小板激活、脂肪酸代谢、军团菌病、长期抑郁、抗生素生物合成、胰升糖素信号通路、Rap1信号通路、昼夜节律缠绕、黑素合成、逆行内源性大麻素信号、胆碱能突触、类固醇合成、谷氨酸能突触、5-羟色胺能突触和AMP激活的蛋白激酶信号通路。

图3 驴和牛初乳中差异表达乳清蛋白的代谢途径图

DEWP的蛋白质-蛋白质相互作用网络

如图4所示，蛋白质-蛋白质相互作用网络包括63个蛋白质和108个相互作用。Annexin A2（P04272）、囊泡相关膜蛋白8（VAMP8；Q3T0Y8）和脂多糖受体（Q5XWB8）与8个蛋白质相互作用最多，其次是α-可溶性NSF附着蛋白（A5D7S0）和突触素同系物YKT6（Q3T000）。

图4 驴、牛初乳差异表达乳清蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

Discussion

在本研究中，驴和牛初乳中分别发现了237和313种独特的乳清蛋白。这种差异可能是由于反刍动物和单胃动物蛋白质代谢和乳蛋白分泌的信号通路明显不同所致。反刍动物瘤胃中的大量微生物能够降解和合成蛋白质，并能更好地利用蛋白质、非蛋白氮和再生尿素作为氮源。其他研究也发现驴和牛乳脂肪之间的显著差异，主要是由于反刍动物中不同的脂肪酸前体。反刍动物的这些特点也可以在一定程度上解释为什么驴乳与人乳比牛乳有更多相似之处。在驴和牛初乳共有的383个乳清蛋白中，发现了80个DEWP（P＜0.05，倍变≥±1.50），其中驴初乳中有21个表达上调，59个表达下调。其中，β-乳球蛋白-2（P19647）是折叠变化值最大的蛋白质（上调），其次是β-乳球蛋白-1（P13613）。β-乳球蛋白是由乳腺上皮细胞合成的一种乳特异性蛋白质，是反刍动物和猪、马、驴等动物乳中的主要乳清蛋白成分，而在人类乳中含量很低。β-乳球蛋白是一种脂蛋白，可以结合许多疏水分子，这表明它在它们的运输中发挥了作用。此外，β-乳球蛋白通过铁载体结合铁，因此可能在对抗病原体方面发挥作用。有趣的是，许多研究表明，包括驴在内的马类动物具有很强的先天和获得性免疫能力；然而，这是否与从初乳中摄入的β-乳球蛋白含量较高有关，仍有待探索。

利用GO注释阐明了DEWP可能参与的功能和生物学过程。大多数DEWP参与CC亚群，特别是胞外外体，其次是质膜和线粒体。细胞自然释放胞外外体和囊泡，它们携带细胞蛋白质、核酸、脂类、代谢物和细胞器。因此，已鉴定的DEWP很可能是由牛乳的不同细胞群体分泌的，包括牛乳分泌细胞、肌上皮细胞以及祖细胞和干细胞的层次结构，这些细胞随后参与形成进入牛乳的细胞外外体和囊泡。然而，还需要进一步的研究来证实这一假说，并揭示其潜在的机制。

囊泡运输中涉及SNAR相互作用的途径是与DEWPs最相关的途径之一，其次是脂肪酸生物合成和雌激素信号途径。SNARE是存在于所有细胞器中的一大类蛋白质，参与胞内囊泡的运输和分泌，并参与内吞和吞噬作用。饮食中的牛乳外泌体及其携带物通过人类血管内皮细胞的内吞作用被运送到外周组织，这取决于人类肠道细胞中的细胞和外泌体表面糖蛋白。本结果表明，蛋白质和其他营养物质参与内吞作用的程度在不同类型的初乳中存在很大差异，这为跨越物种边界、来自不同来源的初乳的饮食核酸的基因调控提供了新的研究方向。然而，还没有验证差异蛋白和关键蛋白在各种代谢途径中的具体表达水平，这是未来研究的方向。

此外，蛋白质-蛋白质相互作用网络表明，DEWPs P04272、Q3T0Y8和Q5XWB8分别与8个蛋白质相互作用，代表一个相互作用最多的节点。Q3TOY8，也被称为VAMP8或endobrevin，参与胰腺腺泡细胞的内吞作用和调节胞吐作用。VAMP8与SNAP特异性地相互作用，很可能是通过含有VAMP8的SNARE复合体，这进一步支持了GO和代谢途径分析的准确性和一致性。总体而言，DEWPs的代谢途径和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析的结果为不同物种之间蛋白质的功能提供了新的见解，进一步反映了不同哺乳动物新生儿的特定需求。这些结果可能提供有关初乳乳清成分的重要信息，为基于多种乳源的婴儿配方乳粉的开发提供对这些重要成分的营养和功能需求的洞察。

Conclusion

本文利用非标记定量蛋白质组学技术对驴和牛初乳中的乳清蛋白进行了研究。共鉴定出933种乳清蛋白，包括两组共有蛋白383种，驴初乳中的特异性蛋白237种，牛初乳中的313种。从383个常见蛋白质中筛选出80个DEWP，并进一步确定了这些DEWP的GO注释、代谢途径和相互作用网络。这些结果可能提供关于初乳乳清成分的重要信息，以及关于这些重要成分对基于多种乳源的婴儿配方乳粉开发的营养和功能需求的重要信息。

Differentially expressed whey proteins of donkey and bovine colostrum revealed with a label-free proteomics approach

Mohan Li^a,1, Qilong Li^b,1, Haikun Yu^a, Xiumin Zhang^c, Dehao Li^d, Wanying Song^a, Yan Zheng^a,*, Xiqing Yue^a,*

^a College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

^b College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

^cBeijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China

^dThe Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110866, China

¹ These authors contributed equally to this work and should be regarded as co-first author.

*Corresponding authors.

Abstract

This study aimed to analyze and compare the differentially expressed whey proteins (DEWPs) of donkey and bovine colostrum using high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry-based proteomics. A total of 620 and 696 whey proteins were characterized in the donkey and bovine colostrum, respectively, including 383 common whey proteins. Among these common proteins, 80 were identified as DEWPs, including 21 upregulated and 59 downregulated DEWPs in donkey colostrum compared to bovine colostrum. Gene Ontology analysis revealed that these DEWPs were mainly related to cellular components, such as extracellular exosome, plasma membrane, and mitochondrion; biological processes, such as oxidation-reduction process, cell-cell adhesion, and small guanosine triphosphate (GTP) ase-mediated signal transduction; and molecular functions, such as GTP binding, GTPase activity, and soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF) attachment protein receptor activity. Metabolic pathway analysis suggested that the majority of the DEWPs were associated with soluble NSF factor attachment protein receptor interactions in vesicular transport, fatty acid biosynthesis, and estrogen signaling pathways. Our results provide a vital insight into the differences between donkey and bovine colostrum, along with important information on the significant components as nutritional and functional factors to be included in infant formula based on multiple milk sources.

Reference:

LI M H, LI Q L, YU H K, et al. Differentially expressed whey proteins of donkey and bovine colostrum revealed with a label-free proteomics approach[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(4): 1224-1231. DOI:10.1016/j.fshw.2022.10.004.