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AhR磷酸化向O-GlcNA酰化的转变有助于苯并[a]芘诱导的血管氧化应激

2024-01-11作者：来源：责任编辑：食品界字体A+AA-

Introduction

苯并[a]芘（B[a]P）是多环芳烃的母体，主要来源于受环境污染的食品或由氨基酸、脂肪酸和碳水化合物热解产生。目前，有一些报道B[a]P会导致血管疾病，如高血压、动脉粥样硬化和腹主动脉瘤。血管平滑肌细胞（VSMCs）作为血管壁的主要组成部分，在心血管稳态和疾病中发挥决定性作用。已有研究揭示了氧化应激在B[a]P处理的VSMCs中的有害/细胞毒性作用。然而，B[a]P诱导VSMCs产生活性氧（ROS）的机制尚不清楚。

芳香烃受体（AhR）是B[a]P的经典受体。B[a]P结合并激活AhR，诱导AhR从细胞质转运至细胞核，与AhR核转运蛋白形成异源二聚体，在转录水平调节细胞色素P450酶的表达，增加ROS的产生。先前的研究发现，在AhR的NLS附近，人类AhR的Ser12和Ser36的磷酸化抑制了配体依赖的核转位。然而，B[a]P诱导AhR去磷酸化转位入核的调控机制尚不清楚。

O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）是一种发生在丝氨酸和苏氨酸残基上的细胞内翻译后修饰。O-GlcNAc糖基化是一个高度动态的过程，其中O-GlcNAc转移酶催化O-GlcNAc加成到目标残基上，而O-GlcNAcas催化O-GlcNAc去除。

本研究证实了B[a]P通过AhR核转位触发VSMCs的氧化应激。AhR在静息状态下被磷酸化，随着B[a]P刺激时间的延长，细胞质中的AhR被O-GlcNAc修饰，直至进入细胞核。AhR在Ser11位发生O-GlcNAc糖基化，Ser11是小鼠AhR已知的磷酸化位点之一。AhR的磷酸化模拟突变体被阻断，但O-GlcNAc糖基化对于AhR的入核和ROS的产生是必需的，并且AhR的磷酸化向O-GlcNAc糖基化的转换有助于AhR与核输入蛋白α的相互作用。

Results

B[a]P在体内和体外诱导VSMCs发生氧化应激

实验发现B[a]P显著增加了饲喂B[a]P的C57BL/6小鼠主动脉的组织重量，增加了胸主动脉和腹主动脉中膜的ROS水平。免疫组织化学染色结果显示，B[a]P升高胸主动脉和腹主动脉中膜NOX4、p47^phox和p-p47^phox的表达（图1A）。同时，蛋白质印迹结果显示，B[a]P处理的主动脉中NOX2和NOX4的表达显著增加（图1B）。

B[a]P以剂量依赖的方式增加VSMC ROS水平，在20 µmol/L时达到峰值（图1C）。蛋白质印迹分析进一步显示，在B[a]P刺激的VSMCs中，NOX2和NOX4的表达明显上调。这些数据表明，B[a]P在体内和体外均促进VSMCs ROS的产生。

如图2A，B所示，B[a]P刺激细胞2 h后，AhR发生明显的核转位，而AhR拮抗剂CH223191可以逆转B[a]P诱导的AhR核转位。同时，B[a]P增加了ROS的产生，CH223191减弱了NOX2和NOX4的表达（图2C）。这些数据表明，AhR核转位的破坏可能与VSMCs中ROS的产生有关。

图2 B[a]P通过促进AhR核转位诱导VSMC氧化应激

AhR O-GlcNAc糖基化与B[a]P诱导的磷酸化存在竞争性抑制关系

免疫共沉淀结果显示，刺激0 h时细胞质AhR发生明显磷酸化，刺激1 h时发生O-GlcNAc糖基化，刺激2 h时几乎检测不到O-GlcNAc糖基化和磷酸化（图3A），这可能是由于刺激2 h时AhR发生了核转位。这些结果表明，在B[a]P刺激下，AhR的O-GlcNAc糖基化和磷酸化之间存在竞争性抑制关系。

图3 AhR O-GlcNAc糖基化与B[a]P诱导的磷酸化存在竞争性抑制关系

在VSMCs中，AhR O-GlcNAc糖基化是其核转位和氧化应激所必需的

免疫荧光和蛋白质印迹结果显示，VSMCs中B[a]P依赖的AhR核转位被siOGT阻断（图4A，B）。同时，B[a]P诱导的氧化应激也被siOGT显著抑制（图4C）。相反，当用siOGA转染VSMCs时，总轮廓的O-GlcNAc糖基化水平显著上调。当VSMCs被siOGA（图4D，E）转染后，B[a]P诱导的AhR核转位更加明显，同时可以捕获更高水平的氧化应激（图4F）。进一步用PUGNAc预孵育后，B[a]P诱导的AhR核转位更加明显，VSMCs氧化应激水平也增加。因此，在VSMCs中，AhR的O-GlcNAc糖基化修饰对其核转位和氧化应激是必需的。

图4 在VSMCs中，AhR O-GlcNAc糖基化是其核转位和氧化应激所必需的

AhR的Ser11位O-GlcNAc糖基化参与AhR的入核和氧化应激

为了研究AhR的O-GlcNAc糖基化与Ser11或Ser35磷酸化之间是否存在竞争性结合，在PUGNAc存在的情况下，将AhR野生型（WT）、S11A突变型、S35A突变型或S11A/S35A双突变型转染293T细胞，突变后总蛋白的O-GlcNAc糖基化水平无明显变化（图5A）。通过免疫共沉淀检测胞质AhR O-GlcNAc糖基化水平，结果显示S11A突变体和S11A/S35A双突变体显著降低了AhR O-GlcNAc糖基化水平（图5B），而S35A突变体对AhR O-GlcNAc糖基化水平没有影响，表明AhR可能在Ser11发生O-GlcNAc糖基化修饰。如图5D，E所示，在293T细胞中，过表达S11A突变体抑制了O-GlcNAc糖基化诱导的氧化应激（图5C）和AhR的入核。结果表明Ser11位的O-GlcNAc糖基化修饰与AhR的入核和氧化应激密切相关。

图5 AhR的Ser11位O-GlcNAc糖基化参与AhR的入核和氧化应激

AhR磷酸化被抑制，而O-GlcNAc糖基化促进AhR核转位和氧化应激

如图6A所示，免疫荧光实验和蛋白质印迹分析结果显示，与S11D突变体相比，O-GlcNAc糖基化AhR模拟物促进了B[a]P诱导的AhR核转位（图6B，C）。DCFH-DA染色和蛋白质印迹分析结果显示，O-GlcNAc糖基化修饰的AhR模拟物促进了B[a]P诱导的氧化应激，而S11D突变体降低了氧化应激的水平（图6D，E）。数据表明AhR磷酸化受到抑制，而O-GlcNAc糖基化促进AhR核转位和氧化应激。与S11D突变体相比，O-GlcNAc修饰的AhR模拟物显著促进了核输入蛋白α与AhR的相互作用（图6F）。揭示了AhR磷酸化向O-GlcNAc糖基化的转变促进了AhR与核输入蛋白α的相互作用。

图6 AhR磷酸化被抑制，O-GlcNAcylation促进AhR核转位和氧化应激

Discussion

近年来，B[a]P作为心血管疾病的重要危险因素日益受到重视，B[a]P通过氧化应激介导。尽管如此，其机制却鲜有研究。本研究揭示了B[a]P通过加速AhR的核转位来促进VSMCs ROS的产生，这一过程是由AhR的Ser11磷酸化转变为O-GlcNAc糖基化介导的，这为血管疾病的预防和治疗提供了新的思路。

本研究证实了B[a]P促进培养的VSMCs中ROS的产生，重点研究了AhR的翻译后修饰对B[a]P诱导的氧化应激的影响，发现B[a]P经口染毒3 d的C57BL/6小鼠体内ROS水平明显升高。用AhR拮抗剂CH223191阻断AhR的核转位可以逆转B[a]P诱导的VSMCs中ROS的产生。因此进一步强调B[a]P可能是血管损伤的独立危险因素，而AhR的配体依赖性核转位可能是理解B[a]P病理生理功能的重要环节。

实验数据表明B[a]P刺激2 h显著促进AhR的核转位。同时，通过提取细胞质蛋白证明了AhR在B[a]P刺激前被磷酸化，并且随着刺激时间的延长，磷酸化水平降低。此外，比较了AhR磷酸化与O-GlcNAc糖基化的时间关系。免疫共沉淀结果显示，胞质AhR磷酸化在0 h达到峰值，O-GlcNAc糖基化在1 h达到峰值。O-GlcNAc糖基化和磷酸化在2 h时几乎检测不到，这是由于AhR在2 h时发生了核转位，如上所述。此外，我们明确了VSMCs中B[a]P依赖的AhR核转位和氧化应激可被siOGT显著抑制，而被siOGA或PUGNAc促进，提示AhR的O-GlcNAc糖基化参与了B[a]P诱导的VSMCs中AhR的核转位和氧化应激。这些数据证实了磷酸化向O-GlcNAc糖基化的转变可能有助于促进AhR的核转位。

在S11A过表达的293T细胞中，发现O-GlcNAc糖基化诱导的AhR入核减少，氧化应激降低，进一步证实AhRS11可能是磷酸化和O-GlcNAc糖基化的主要竞争性结合位点。翻译后修饰可以调节蛋白质稳定性、蛋白质相互作用和亚细胞定位。核输入蛋白α作为接头分子，识别NLS并链接到输入蛋白β，输入蛋白β将三元复合物对接在核孔复合物（NPC）上，促进AhR跨核膜转运。这些数据进一步扩展了我们对AhR如何通过调节自身的翻译后修饰来适应外界环境线索的理解。

综上所述，本研究证实了AhR磷酸化向O-GlcNAc糖基化的转变在AhR核转位和随后的氧化应激放大中发挥了关键作用。揭示了VSMCs对外部环境刺激的自我调控机制，并强调了蛋白质翻译后修饰在血管稳态中的重要性，这可能为通过干预蛋白质翻译后修饰治疗血管疾病提供了一种可供选择的方法。

Switch of phosphorylation to O-GlcNAcylation of AhR contributes to vascular oxidative stress induced by benzo[a]pyrene

Rong Wang^a, Yun Huang^a, Xiaoruo Gan^a, Chenghao Fu^a, Yuemin Li^a, Ning Chen^a, Hao Xi^a,, Huishan Guo^a, Wei Zhang^b, Yuhong Lü^a, Yan Zhang^c,*, Pin Lü^a,*

^a Cardiovascular Medical Science Center, Department of Cell Biology, Key Laboratory of Neural and Vascular Biology of Ministry of Education, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China

^b Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050091, China

^cEco-environmental Monitoring Center of Hebei Province, Shijiazhuang 050031, China

*Corresponding author.

Abstract

Benzo[a]pyrene (B[a]P) is a food contaminant toxic for cardiovascular diseases. The nuclear translocation of Arylhydrocarbon receptor (AhR) plays an important role in B[a]P-induced oxidative stress and vascular diseases. We confirmed that B[a]P promoted ROS production in vascular smooth muscle cells (VSMCs) in vitro and in vivo, associated with the nuclear translocation of AhR. It is known that phosphorylation inhibits while dephosphorylation of AhR promotes nuclear translocation of AhR. However, from the posttranslational modification level, the mechanism by which B[a]P activates and regulates the nuclear translocation of AhR is unclear. Co-immunoprecipitation results showed that cytoplasmic AhR was phosphorylated before B[a]P stimulation, and switched to O-GlcNAcylation upon B[a]P 1-h stimulation in VSMCs, suggesting there may be a competitively inhibitory relationship between O-GlcNAcylation and phosphorylation of AhR. Next, siRNAs of O-linked N-acetylglucosamine transferase (OGT), O-GlcNAcase (OGA) and OGA inhibitor PUGNAc were used. SiOGT blocks but siOGA and PUGNAc promote B[a]P -dependent AhR nuclear translocation and oxidative stress. Ser11 may be the competitive binding site for phosphorylation and O-GlcNAcylation of AhR. Phosphorylation-mimic variant inhibits but O-GlcNAcylation of AhR promotes AhR nuclear translocation and oxidative stress. Our findings highlight a new perspective for AhR nuclear translocation regulated by the competitive modification between phosphorylation and O-GlcNAcylation.

Reference:

WANG R, HUANG Y, GAN X R, et al. Switch of phosphorylation to O-GlcNAcylation of AhR contributes to vascular oxidative stress induced by benzo[a]pyrene[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2263-2275. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.046.

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