食品界

东北农业大学李晓东教授：Nisin结合加压CO2处理对枯草芽孢杆菌芽孢结构和胞内成分泄漏的影响

东北农业大学食品学院的潘悦博士研究生（第一作者）和李晓东教授（通信作者）研究乳酸链球菌素（nisin）和高压二氧化碳（high-pressure carbon dioxide，HPCD）对枯草芽孢杆菌孢子中核酸、可溶性蛋白、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺和吡啶二羧酸结构变化和渗漏的协同作用。HPCD和Nisin均用于灭活枯草芽孢杆菌孢子。HPCD联合Nisin处理的孢子死亡率显著高于单独使用HPCD处理的孢子。孢子死亡的主要原因是由于孢子渗透性的变化和结构损伤引起的组分渗漏。HPCD处理破坏了孢子的超微结构，导致核酸、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺和吡啶二羧酸从孢子中泄漏，而HPCD结合Nisin破坏了孢子膜，导致孢子死亡，二者发挥协同作用。该研究评价了HPCD和Nisin的协同作用，为HPCD和Nisin的潜在联合应用提供了依据。

Introduction

食品杀菌对食品加工和安全至关重要。与高温加热相比，加压二氧化碳（HPCD）的处理条件更温和，可以在不改变食品风味和营养成分的情况下灭活微生物。然而单独用HPCD处理不能有效失活细菌孢子。因此，在确保食品质量的同时，利用安全高效的食品添加剂辅助HPCD灭活孢子至关重要。Nisin是一种含有34个氨基酸残基的肽，可抑制或灭活食品中的革兰氏阳性腐败菌，尤其是细菌孢子。HPCD和Nisin的协同杀菌活性已被食品工业用于灭活细菌营养体，然而，对于具有更高抗性的细菌孢子，HPCD与Nisin联合作用的影响尚不清楚。本研究选择枯草芽孢杆菌孢子作为模型体系，研究了HPCD和Nisin联合处理对芽孢结构和胞内成分泄漏的影响及机制。

HPCD处理120 min后孢子失活率为79.04%，而Nisin-HPCD处理90 min后孢子失活率为97.82%，显著高于单一处理组（P<0.05），说明Nisin结合HPCD灭菌产生了协同作用。

图1 Nisin-HPCD对枯草芽孢杆菌孢子的灭活效果

图2 Nisin-HPCD对枯草芽孢杆菌芽孢内核酸泄漏量（A）、芽孢内蛋白泄漏量（B）和芽孢内2,6-吡啶二羧酸泄漏量（C）的变化

核酸及其衍生物是重要的细胞成分，在正常情况下不会泄漏到细胞外空间。因此，核酸泄漏量可以间接指示对孢子壁/膜的损伤程度。不同处理组中泄漏核酸的吸光度值随着作用时间的增加而增加。然而，在0~90 mim之间，Nisin-HPCD处理后的核酸渗漏程度大于HPCD或Nisin单次处理后的渗漏程度，并且差异显著（P<0.05）。2,6-吡啶二羧酸（DPA）是芽孢的特征性物质，其主要存在于芽孢的核心，而没有发现其存在于细菌的营养体中。在HPCD处理组和Nisin-HPCD处理组中均发生了DPA的泄漏现象，同时，Nisin-HPCD处理组中DPA的泄漏量均高于HPCD处理组，这说明Nisin的添加增大了芽孢内DPA的泄漏量。

图3 Nisin-HPCD对枯草芽孢杆菌芽孢内Mg²⁺漏量（A）、Ca²⁺泄漏量（B）和K⁺泄漏量（C）的变化

Mg²⁺、Ca²⁺和K⁺稳定细胞壁和膜结构，K+在调节细胞膜通透性方面也起着关键作用。因此，这些金属离子的泄漏损坏了壁和膜。Nisin-HPCD处理后孢子会泄漏更多的Ca²⁺、Mg²⁺ 和K⁺。然而，在Nisin处理组中，Mg²⁺、Ca²⁺ 和K⁺的泄漏浓度最小，这可能是因为Nisin单独处理对孢子结构的影响可以忽略不计。

（A）未经处理；（B）Nisin处理；（C）HPCD处理；（D）Nisin-HPCD处理。

图4 枯草芽孢杆菌孢子的透射电子图像

未经处理的孢子包膜完整清晰，孢子呈光滑椭圆形，说明孢子结构未发生明显变化。孢子样品处理后孢子结构发生明显变化，出现皱纹，胞内成分变薄，呈现异质性，Nisin-HPCD处理后芽孢被刺破。

总之，HPCD对孢子壁和孢子膜具有损伤作用，而Nisin具有协同杀菌作用，使胞内化合物渗漏增加，导致孢子死亡。

Abstract

The synergetic effect of nisin and high-pressure carbon dioxide (HPCD) on structural changes and leakage of nucleic acid, soluble proteins, Mg²⁺, Ca²⁺, K⁺, and dipicolinic acid from Bacillus subtilis spores was studied. Both HPCD and nisin auxiliary were used to inactivate the B. subtilis spores. The death rate of spores treated by HPCD combined with the nisin were significantly higher than HPCD alone (P < 0.05). The main cause of spore’s death is the leakage of components caused by the change of spore permeability and structural damage. The HPCD treatment damaged the spore ultrastructure, resulting in the leakage of nucleic acid, Mg²⁺, Ca²⁺, K⁺, and dipicolinic acid from spores, while nisin auxiliary to HPCD treatment damaged spore membrane, which led to spore death and play a synergetic effect. This study evaluated synergetic effects of HPCD combined with the bacteriocin nisin. The investigation provided evidence for potentially combined application of HPCD and nisin to help ensure food safe in the industry.

专家及作者介绍

李晓东教授

东北农业大学食品学院

李晓东，博导，教育部食品工业职业教育教学指导委员会委员，黑龙江省教学名师，东农杰出学者JC2，美国佛蒙特大学访问学者。现任黑龙江省高值化食品生物加工及功能性产品开发工程技术研究中心主任，乳品营养组学及功能性乳制开发品团队负责人。兼任中国畜产品加工研究会理事，中国食品科学技术学会乳酸菌分会理事，省发酵工程学会副理事长，省科顾委食品专家组专家，省食品科学技术学会常务理事。《乳品科学与技术》、Food Science of Animal Products杂志编委，Foods、Frontiers in Nutrition客座主编。主要从事乳品科学与技术，特别是干酪及乳基料、婴幼儿配方粉、功能性乳制品等领域的科研和教学工作。

主持、参加国家科技支撑、国家重点研发计划项目、国家教育部创新团队、教育部博士学科点基金、黑龙江省重点研发计划项目、黑龙江省重大专项、黑龙江省百千万工程重大专项等各类课题30余项。获黑龙江省科学技术奖3项，厅局级奖励6项，中国食品科学技术学会奖励1项。授权专利18项。主编出版教材、专著《乳品工艺学》、《新型干酪食品加工技术》12部，共发表学术论文300余篇，发表SCI/EI论文80余篇。

潘悦博士研究生

东北农业大学食品学院

潘悦，东北农业大学食品学院食品科学专业2022级博士研究生。共计发表科研论文9 篇，其中中科院一区SCI论文7 篇，EI论文2 篇；作为项目核心成员参与黑龙江省百千万课题、省重点研发计划、省自然优青基金等各类课题5 项；获省高校科学进步奖1项，中国食品科学技术学会创新奖1 项。