黑龙江八一农垦大学张东杰教授等：食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽：构效关系、安全性及生物利用度研究进展
2023-12-08作者：来源：责任编辑：食品界
字体A+AA-
由胰腺β细胞功能受损、胰岛素代谢紊乱所导致的糖尿病是世界性代谢紊乱疾病，血糖偏高和血脂持续异常是该疾病的主要病理特征，可分为1型、2型（T2DM）和妊娠型。其中T2DM占患病人群的90%以上。大量研究已证实，一些食品源生物活性成分（肽、酚类、萜类等）具备优异的α-葡萄糖苷酶抑制潜能，其中由食源蛋白制备的α-葡萄糖苷酶抑制肽具有营养属性，因其生物利用度高、T2DM治疗效果明显、与传统α-葡萄糖苷酶抑制剂相比副作用低等特点受到研究界的广泛关注，食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备与研究已成为热点。
黑龙江八一农垦大学食品学院李志明、张舒、张东杰*等使用ScienceDirect、中国知网高级检索，采用在线工具ToxinPred预测肽段分子质量、净电荷（pH 7.0）、理论等电点（pI）、疏水性和毒性；采用Allergen FP v.1.0分析肽段致敏性；采用ADMETlab和SwissADME等工具较全面地评估α-葡萄糖苷酶抑制肽的生物利用度。旨在进一步补充α-葡萄糖苷酶抑制肽的结构特性，并运用生物信息学方法深入阐述具有α-葡萄糖苷酶抑制肽结构特征的系列肽段具有安全隐患的概率，以及其对胃肠腔环境、黏液等生化及物理屏障的穿透能力，以期侧面反映其开发成高品质、多功能降糖肽的潜力。
1.1 链长、分子质量、氨基酸组成、序列与α-葡萄糖苷酶抑制活性的关系
如表1所示，有32 条α-葡萄糖苷酶抑制肽的半抑制浓度（IC50）小于阿卡波糖（IC50＝201 μmol/L）。这62 条α-葡萄糖苷酶抑制肽链长位于2～16之间，由2～9 个氨基酸残基组成的多肽数量占总数的90.32%，研究频率最高的是四肽（10 个）、五肽（9 个）和七肽（9 个），其中链长3～7范围内的多肽具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50＜80 μmol/L），提示该链长区间的多肽有更强的抑制潜能。α-葡萄糖苷酶抑制肽不同分子质量片段频率如表2所示。经过统计分析可知，62 条α-葡萄糖苷酶抑制肽中，分子质量小于600 Da的α-葡萄糖苷酶抑制肽出现频率高达48.39%，说明其是α-葡萄糖苷酶抑制肽的主流分子质量；且IC50＜20 μmol/L的α-葡萄糖苷酶抑制肽平均分子质量为574.57 Da（表3），说明分子质量低于600 Da的α-葡萄糖苷酶抑制肽活性更高。事实上，由于肽与α-葡萄糖苷酶有效亲和力的要求，过长的肽段对二者的结合效果存在负面影响。本文所分析的α-葡萄糖苷酶抑制肽的链长在3～7之间，与Ibrahim等总结的链长3～6不同，从两方面考虑：一是链长在3～7之间的α-葡萄糖苷酶抑制肽满足与α-葡萄糖苷酶的结合要求；二是研究发现这两类α-葡萄糖苷酶抑制肽（六肽和七肽）的抑制效果差异不显著。
如图1所示，Pro、Leu、Ala在α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸组成上占重要地位，在其肽段上的出现频率最高。Pro除在增强α-葡萄糖苷酶抑制肽的抑制能力中显示重要作用外，在与血管紧张素转化酶（ACE）、DPP IV酶催化/活性位点键合上也占有独特优势。多项研究表明Pro的环形亚氨胺结构可使整条肽链发生折叠，出现构象不规则变化，进而造成肽链结构约束，这可能是其发挥功效的关键因素。含大量Leu的大豆蛋白肽（LLPLPVLK）和核桃蛋白肽（LPLLR）表现出高效的α-葡萄糖苷酶抑制活性，适合出现在N端（图1）。同时，Ala也可显著提升α-葡萄糖苷酶抑制肽的活性，蛋黄蛋白肽YINQMPQKSRE在引入Ala后IC50值大幅下降，抑制活性显著提升。本文认为Pro、Leu、Ala是α-葡萄糖苷酶抑制肽组成上的重要氨基酸残基。在其他研究中也已经证实Pro、Leu、Ala对胰岛素分泌有显著改善作用。这些证据表明，Pro、Leu、Ala不仅是保证α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的分子基础，更是利用抗糖尿病活性肽管理和预防T2DM的关键因子。今后应重点研究并解析Pro、Leu、Ala对α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的影响，以期为α-葡萄糖苷酶抑制肽的高效率筛查提供参考（图2）。氨基酸序列是影响生物活性肽生理活性的关键结构性质，氨基酸组成相同但序列不同的多肽功能特性和活性存在显著区别。由图1可知，Ala、Ser在N端出现频率较高。此外，本文中活性最强的α-葡萄糖苷酶抑制肽N端出现芳香族氨基酸残基（Phe和Trp），推测这两类氨基酸残基有增强α-葡萄糖苷酶抑制能力的作用。C端碱性氨基酸Arg和Lys的出现频率极高（分别为27.59%和20.69%）。肽段C端Arg的存在可提高肽-酶结合稳定性，保证肽与酶关键活性氨基酸残基的强结合，从而提高其抑制活性。Lys在活性排名前3 位的FDPFPK、AAAPVAVAK中均有出现，提示Lys也是保证α-葡萄糖苷酶抑制活性的必要氨基酸残基。
在了解上述α-葡萄糖苷酶抑制肽氨基酸组成规律后，通过氨基酸分析等方法了解亲本蛋白的氨基酸组成，能在一定程度上判断该底物开发成α-葡萄糖苷酶抑制肽的潜力（图2）。燕麦蛋白的Pro、Leu、Ala、Arg相对含量均处于较高水平（分别为6.59%、8.39%、6.90%和6.39%），由其制备得到的α-葡萄糖苷酶抑制肽GDVVALPA和DVVALPAG的“Pro＋Ala＋Leu”占比达50%，已被证明是制备α-葡萄糖苷酶抑制肽的优质蛋白来源。依据此思路，提高亲本蛋白Pro、Leu、Ala等氨基酸的含量有助于制得高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽。植物性蛋白来源中的薏仁醇溶蛋白和菜籽饼粕蛋白和富含Pro的鱼类胶原蛋白都可作为生产α-葡萄糖苷酶抑制肽的优质原材料，亟待开发与研究。 1.2 净电荷、等电点、疏水性与α-葡萄糖苷酶抑制活性的关系
如表1所示，62 条α-葡萄糖苷酶抑制肽净电荷范围在－4～＋3，其中高活性的多肽为0或＋1。此外，高电荷肽高电荷肽AEEEYPDL（电荷为－4，IC50＝5 580 μmol/L）和CGKKFVR（电荷为＋3，IC50＝621.23 μmol/L）的α-葡萄糖苷酶抑制活性远低于其他多肽，可见高电荷会大幅削弱其抑制活性。本文同时发现，多肽等电点对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响微乎其微。 根据相关性分析可知，疏水性与α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性较低（Pearson相关系数r＝0.207）。但最近几年的研究也表明，α-葡萄糖苷酶抑制肽与α-葡萄糖苷酶分子的结合存在大量疏水相互作用模式。另外，其他非共价作用力也积极参与肽-酶作用过程。以上结果与多肽的亲水/疏水性平衡、特有酸碱性质（pH值和净电荷）所支配的构象能量平衡、结合位姿密切关联。 基于ToxinPred服务器中1 805 个有毒肽、3 593 个无毒肽构建肽数据集，采用支持向量机（SVM）监督机器学习算法（输入SVM阈值＝0.0）对所选62 条α-葡萄糖苷酶抑制肽的毒性进行预测，由表1可知，全部多肽均无毒。作为膳食蛋白制备的食源活性肽，对其安全性的评价仍存在争议，尤其是利用新基底、新加工工艺和非消化酶配制及提取的新肽。目前，除针对各肿瘤细胞的体外毒性实验外，关于食物蛋白源形成毒性蛋白的证据有限，但通过对有毒活性肽的结构参数进行研究，现已初步了解到有毒活性肽的部分结构特征。现有的证据表明，有毒活性肽可能具有以下特征：1）肽段中带有LKL、KWK、FKK、KKLL和CYCR序列；2）肽段中出现以聚谷氨酰胺（poly Q）为基序的重复序列；3）肽段中出现以Cys为基序的蝎毒素样结构域（识别的基序为CN37CN3-6CN0-5CN1-4CN4-13C，“C”表示Cys，“N”表示氨基酸，“3～7”表示氨基酸的潜在数量）的重复序列。活性肽除具有上述结构表征而表现出毒害作用外，其服用剂量和持续服用时间等因素也不容忽视。综上，即使本文发现α-葡萄糖苷酶抑制肽不含有毒肽的结构特征，但如将α-葡萄糖苷酶抑制肽作为功能性产品干预T2DM，还需进行系统和完整的体内和临床试验，以便进一步保证其安全性。 本文使用Allergen FP v.1.0服务器对α-葡萄糖苷酶抑制肽的致敏性进行预测，该web服务器内包含2 427 个过敏原和2 027 个非过敏原的蛋白质数据集，数据集的蛋白质中氨基酸序列由5 个E-描述符（E1：氨基酸疏水性；E2：氨基酸分子质量；E3：氨基酸的螺旋形成倾向；E4：氨基酸相对丰度；E5：β链的形成倾向）所描述，同时使用自动交叉协方差（ACC）的蛋白质序列挖掘工具对数据集内蛋白质的序列长度进行统一，判别系数“Tanimoto”将蛋白质区分为过敏原或非过敏原。通过上述预测模型，有35 条α-葡萄糖苷酶抑制肽被鉴定为潜在过敏原，这些多肽与数据集内已知的过敏原具有类似的氨基酸组成或肽基序，并带有抗原表位。作为过敏原的蛋白或多肽（有B细胞表位）被免疫球蛋白E（IgE）抗体识别并结合后触发IgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面FcεR受体的交联反应，进而激发免疫，释放炎症介质、前列腺素和白三烯，进而引发过敏。由表1可知，被鉴定为过敏原的α-葡萄糖苷酶抑制肽链长度在3～16范围内，以三肽、四肽、七肽和八肽为主。但一般来说，过敏肽以长链居多，短肽因缺乏三级结构，IgE与FcεR受体的交联能力较差，不易诱发过敏反应。目前没有足够的证据完整表述过敏肽的基序，现主要通过一些数据库对待测肽段的过敏潜力进行初步预测，可用的数据库包括Allergome、WHO/IUIS、过敏原蛋白结构数据库（SDAP）、BIOPEP-UWM数据库和Allergen FP v.1.0在线平台等。例如，有研究者通过BIOPEP-UWM数据库成功预测了多条κ-酪蛋白过敏肽（RPKHPIKHQG、NENLLRFFVA和FFVAPFPEVFGK）。另外，从表1中可以观察到，这35 条过敏肽中有12 条具有胃肠道消化酶抗性，比例达到1/3以上。有报道称，具有胃肠道消化酶抗性的多肽更易引发机体过敏，原因在于胃肠道消化酶抗性肽一般具有紧凑结构，保护了致敏抗原表位的完整构象，尤其是当肽段中带有足够数量的半胱氨酸时，由于其形成的二硫键所产生的强大空间位阻，不仅有助于阻止水解物的切割效应，也会对过敏肽的抗原表位进行保护。
当食物亲本蛋白本身就是潜在过敏原时，该蛋白会携带能引发过敏等不良反应的B细胞表位，其在活性肽制备过程中也不可避免地被释放，但可以通过蛋白酶水解、菌种发酵、加热、辐射、高静水压（HHP）等方式破坏IgE与表位的结合以降低食源蛋白的致敏性。主要原理是通过加工处理破坏抗原表位，或使表位构象发生改变，进而降低抗原性。尽管有研究指出，过敏源的主要特征（尤其是带有过敏潜力的活性肽结构特征）未被完整描述，但通过上述途径可在一定程度上避免产生带有致敏原性的活性肽。本文的分析结果提示未来在进行α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究时，需格外关注所制得α-葡萄糖苷酶抑制肽的致敏性。
采用Expasy在线平台的“PeptideCutter”工具模拟胃肠道消化酶的水解，选用胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对62 条α-葡萄糖苷酶抑制肽的消化酶抗性进行考察，并通过BioPEP-UWM数据库的“搜索活性片段”功能将释放的肽序列进行生理活性匹配（表4）。α-葡萄糖苷酶抑制肽在进入消化系统后，会面临胃肠腔内不稳定环境和酶降解的生物屏障，pH值的波动影响多肽的电离程度、降解作用和传递效率，接触的消化酶和肽酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰弹性酶、羧肽酶A/B和刷边肽酶（羧肽酶M和氨基肽酶A/N/P/W），切割后不可逆地改变多肽结构和生物活性。活性肽在胃肠环境下的抗性主要体现在两个方面：一是肽段本身缺乏消化酶的切割位点；二是由于特定氨基酸残基组成和序列干扰酶活性位点的空间或静电排列，从而阻止酶切反应的发生。本文所研究的α-葡萄糖苷酶抑制肽中有25 条对胃肠道消化酶耐受，其中链长在3～7的肽段占76%，这25 条胃肠道消化酶抗性肽平均分子质量为554.56 Da，且大部分肽段分子质量在300～500 Da之间。大多数抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽含有P r o 残基（如P G G P、QPHQPLPP和IPP等），推测Pro可通过环化邻近氨基酸侧链使其回到肽主链，从而保证肽的刚性结构，进而限制蛋白水解酶对邻近氨基酸残基的切割作用，考虑到电荷性质、疏水性等特性，本文总结了关于胃肠道消化酶抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽可能的结构特征（图2）：1）链长3～7；2）分子质量300～500 Da；3）pH 7.0时净电荷为0或＋1；4）低疏水性；5）肽段中出现数量较多的Pro。上述归纳的具有胃肠道消化酶抗性的α-葡萄糖苷酶抑制肽的结构特点与Ahmed等总结的胃肠道内稳定肽（主要是ACE抑制肽、抗氧化肽）的序列特征一致，在符合胃肠道内稳定肽结构特征普遍性的同时保证了胃肠道消化酶抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽的独特性。 黏液层是覆盖肠道上皮的保护性屏障，可分为外层黏液（松散黏液）和内层黏液（坚硬黏液），黏液属于一种水凝胶，覆盖有黏蛋白、脂类、细胞碎片和细菌等物质，该屏障主要通过两种机制调控多肽渗透效率：一是多肽与带负电荷黏蛋白特异性结合；二是由黏蛋白纤维构成的网状结构阻隔多肽的渗透。其中，黏蛋白是黏液的主要功能成分，其主体构成是质量分数占50%～80%的糖蛋白，由于其末端唾液酸和硫酸盐基团的存在，使黏蛋白在黏液中携带负电荷。由于上述黏液层的特点使得亲水性和带净正电荷的多肽在跨越该屏障时占优势（图2）。对照本文总结的α-葡萄糖苷酶抑制肽结构特征，疏水性、0或＋1净电荷状态使α-葡萄糖苷酶抑制肽在黏液层渗透时会有阻力，今后可考虑搭配食品级渗透增强剂（柠檬酸、脂肪酸和壳聚糖等）以提升其渗透效率。 α-葡萄糖苷酶抑制肽在小肠黏膜处发挥α-葡萄糖苷酶抑制活性的同时，也具有对α-淀粉酶、DPP IV酶和葡萄糖转运体（GLUT）家族等抗糖尿病靶标的抑制功能，在体内吸收并进入体循环后通过多种途径协同调控T2DM，这种现象已在体外抗T2DM靶酶活性抑制实验、细胞及动物实验中得到了验证。在表4中，本文借助ADMETlab在线平台预测了62 条α-葡萄糖苷酶抑制肽的Caco-2渗透性和肠道吸收率。其中，人肠道Caco-2细胞通常用于体外测定多肽的口服生物利用度，且为降低体内与体外实验的区间误差，常采用Caco-2与分泌黏液的人结直肠癌上皮细胞HT-29共培养。如表4所示，4 个环肽Cyclo（PL）、Cyclo（PV）、Cyclo（PF）和Cyclo（HP）的Caco-2渗透性和人体肠道吸收率明显高于其他α-葡萄糖苷酶抑制肽，生物利用度评分也都在0.55的高水平。一般来说，具有较强构象弹性的环肽可通过细胞旁转运，并且其Caco-2细胞渗透性显著高于线形肽。多肽的氨基酸序列也会影响其生物利用度。具体来说，C端氨基酸带正电和N端出现Cys、Leu、Met、Pro、Val和Ile有助于提升其渗透性。依据以上分析和各转运途径特点，可在一定程度上了解并判断已筛查的α-葡萄糖苷酶抑制肽所采用的转运途径和转运效率，进一步明确其在体内吸收、分布、代谢和排泄（DME）情况（图2）。 多肽通过肠屏障和抵抗P-gp后转经肝门静脉系统，肝屏障中存在大量代谢酶，可针对性灭活亲脂类物质。代谢酶属于CYP-450家族，包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4这些参与多肽代谢的人类CYP酶，其对分子的初级代谢起关键作用，整个过程被称为首过代谢。在这个过程中，多肽物质通过CYP-450家族与功能性氧化酶混合反应催化以实现多种官能团羟基化，从而完成生物转化，期间涉及N—和O—脱烷基化、甲基化、乙酰化和硫酸化等反应，最终影响多肽的生物活性。但是，对于α-葡萄糖苷酶抑制肽在此阶段生物利用度的研究明显不足，作为进入血液循环的关键一环，深入探究该屏障对α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的影响规律有助于阐明α-葡萄糖苷酶抑制肽作为多功能降糖肽的结构潜力和应用前景。 随着T2DM患病率的逐年上升，近些年人们将对治疗手段或替代药物的关注放在天然食物活性成分的提取或制备上，食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽在预防和干预T2DM中已展现出巨大的潜力。明晰高活性食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的结构特点有助于更有效率、更有针对性地进行食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽段的筛选，并进一步分析和判断其安全性、生物利用度等生物学特点。
尽管现阶段关于高活性食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的结构特征有一定的研究，但大都停留在氨基酸组成及排序、分子质量、疏水性等结构参数的单一解释上，未建立起整合各结构特性的构效关系研究体系。研究肽-酶分子作用机制的工具主要借助于分子对接技术，未积累足够数据填补生化实验与虚拟对接之间的信息误差，未来研究可运用X射线晶体学、表面等离子体共振等新兴技术深入探究食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽与α-葡萄糖苷酶的作用模式。此外，在该类活性肽的研究与开发中，人们将目光集中到了制备工艺的优化、活性的提升及作用机制的解析上，而忽视了对其安全性的评价和对毒性肽及过敏肽结构特征的系统性总结，本文对该方面进行了初步探讨，但未深入讨论食物蛋白提取、预处理和制备过程中导致肽的分解、外消旋和环化等其他情形，这些局限使其作为功能性食品或药物的安全性和功效无法得到保证。目前，关于该抑制肽的活性研究虽较多，但均停留在体外验证阶段，对体内吸收部分未能充分考虑。其次，小肠上皮细胞刷状缘是肽发挥活性的重要场所，在研究时易被忽视，外翻肠套实验可在体外模拟情况下顾及到该部位，从而使实验结果更接近人体真实情况。未来也需多关注食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽摄入后在胃肠道、小肠黏膜、小肠上皮细胞及肝脏代谢等过程中的活性保持、转运效率、代谢组学等情况，这不仅可以了解其在各转运阶段降解、代谢及受损的状况，也可为明确食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的多功能研究提供数据支撑，以促进降糖肽的开发利用。
本文《食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽: 构效关系、安全性及生物利用度研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷15期298-309页. 作者：李志明，张舒，孟维洪，张家瑜，张东杰. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220822-258.
