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—— 中国食品杂志社
构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant，scFv)文库，为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠，分离其脾细胞；Trizol法抽提总RNA，反转录成cDNA，PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv 文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5＇端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点，3＇端添加间隔区序列(T20-V109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明：用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000；成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb；核糖体展示scFv文库基因大约1200bp；库容量达1.75×1013；阳性重组质粒均含有1200bp插入片段；利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明，重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到，且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上；氨基酸序列比对结果表明，重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%，轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。
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