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—— 中国食品杂志社
本研究针对工业发酵中杂菌污染问题，以枯草芽孢杆菌为宿主，利用亚磷酸脱氢酶基因（ptxD）构建无抗性筛选标记的工程菌株，实现非灭菌条件下的高效抗污染发酵。采用“即插即用”聚合酶链式反应（prolonged overlap extension-polymerase chain reaction，POE-PCR）技术，构建ptxD基因表达载体，并通过启动子优化提升亚磷酸代谢效率，使工程菌在亚磷酸培养基中生长速率达原始菌株的1.56 倍；经30 代适应性进化后，菌株亚磷酸代谢能力进一步增强，其生长速度较第1代提升1.34 倍。为构建绿色安全体系，成功去除了卡那霉素抗性基因，获得了无抗性工程菌，可在以亚磷酸为唯一磷源的培养基中稳定生长。非灭菌发酵验证结果表明：镜检及梯度涂布显示菌体形态均一；16S rRNA扩增条带单一，同源性大于99%；高通量测序证实，亚磷酸生料发酵72 h后芽孢杆菌属相对丰度达98.77%。本研究在枯草芽孢杆菌中建立基于亚磷酸脱氢酶的无抗性筛选系统，实现了工程菌非灭菌生料发酵，无需高温灭菌及抗生素添加，可为工业生物制造提供绿色安全解决方案。
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