淋巴细胞多肽的分离鉴定

从小鼠脾脏中提取LPS刺激前后的淋巴细胞后，通过流式细胞仪进行淋巴细胞纯度的测定达到98.3%，进一步进行多肽的分离，将分离后的多肽用纳升液相-Q Exactive四级杆超高分辨轨道阱质谱仪进行鉴定，PEAKS X软件搜库分析后共发现了385 种多肽，其中309 种来自LPS刺激的实验组，149 种来自对照组，有73 种多肽同时位于实验组和对照组中，结果表明，淋巴细胞经LPS刺激后，多肽数量和种类发生了很大的变化。在细胞经外界刺激后产生的免疫反应过程中，免疫细胞是通过免疫因子作用于靶细胞来完成免疫应答反应中的关键环节，而免疫因子实则就是不同种类的多肽。所以，淋巴细胞受LPS刺激后产生的新型多肽很可能具有一定的活性功能。

多肽生物活性预测

将发现的新肽用Peptide Ranker软件和BIOPEP进行功能活性分析，其中有6 种多肽的评分高于0.8，表明其具有很高的生物活性。而6 种多肽中具有DPP-IV的抑制活性片段是最多的，DPP-IV抑制剂是一种用于治疗II型糖尿病的药物，说明这6 种多肽可能具有一定的降血糖功能，因此，对这6 种生物活性肽进行进一步的DPP-IV抑制功能验证。

表1 BIOPEP检索的生物活性片段

六种新型生物活性肽的DPP-IV抑制活性探究

建立pNA标准曲线，构建DPP-IV抑制剂筛选模型，用该模型验证六种新型肽对于DPP-IV的抑制率。结果表明，多肽SAPRHGSLGFLPRK（IC50: （23.443 7±1.04） mg/L）和多肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK（IC50: （84.193 9±2.87） mg/L）表现出了更好的DPP-IV抑制潜能。

图2 六种多肽的DPP-IV抑制率曲线

进一步测定多肽SAPRHGSLGFLPRK和 多肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的DPP-IV抑制类型，通过林-贝氏（Lineweaver-Burk）双倒数作图法拟合方程，对其抑制类型评估发现多肽SAPRHGSLGFLPRK的抑制类型属于竞争性抑制，其通过结合酶的活性位点来抑制酶与底物的结合；而多肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的抑制类型属于非竞争性抑制，其通过其它位点与酶结合，同时不影响底物与酶的结合。多肽SAPRHGSLGFLPRK的DPP-IV抑制活性可能与其含有大量的疏水氨基酸和N末端P1位上的丙氨酸有关，同时两种多肽C末端上的赖氨酸残基也会显著提高其DPP-IV抑制活性。其中多肽SAPRHGSLGFLPRK是在经LPS刺激后发现的，这表明淋巴细胞在经外界刺激后可能会产生更具有功能活性的多肽。

图3 不同浓度多肽SAPRHGSLGFLPRK的Lineweaver-Burk图

图4 不同浓度多肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的Lineweaver-Burk图

本研究建立了一种小鼠淋巴细胞中多肽分离鉴定方法，这其中共发现了131 种新型肽，包括LPS刺激前的多肽（45 种）和LPS刺激后的多肽（108 种），其氨基酸长度在8~30氨基酸范围内，经分析后发现细胞在经外界刺激后会产生更多具有功能活性的多肽；同时，又运用了一种用于探究DPP-IV抑制功效的模型发现两种新型多肽SAPRHGSLGFLPRK和多肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK均具有潜在的DPP-IV抑制功能，其IC50分别为（23.443 7±1.04） mg/L和（84.193 9±2.87） mg/L，抑制类型分别为竞争性抑制和非竞争性抑制。此外，还需进一步通过分子对接的方式探索分子结构间的相互结合，这将有助于生物活性肽相关的保健品和特医食品的开发。