高效酶解制备的磷酸肽钙复合物对小鼠钙吸收和骨沉积的影响

2022-11-25 14:54:34

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Introduction

钙在机体内发挥着重要的作用，例如作为细胞信使发挥信号传递功能、凝血功能、肌肉收缩以及构成机体等重要功能。因此，钙缺乏可导致代谢性骨骼病等，危害健康。膳食摄入量是补充身体钙的唯一途径，然而，在肠道碱性环境或存在其他膳食成分如草酸和植酸时，离子钙容易与之形成不溶性复合物，导致钙的吸收和利用不足。有研究表明，酪蛋白磷酸肽（CPPs）可以结合钙离子形成可溶性肽-钙复合物，促进钙的吸收，并且改善骨中钙的积累。酪蛋白产生的CPPs可以通过上调Caco-2细胞的TRPV6关键钙转运蛋白表达来促进钙转运，可以促进大鼠肠细胞TRPV6的表达。卵黄高磷蛋白磷酸肽，由蛋黄颗粒中的卵黄高磷蛋白酶解产生，与酪蛋白磷酸肽有相似结构的，且较酪蛋白具有更高的磷酸化水平。

卵黄高磷蛋白（Phosvitin，PV）是卵黄中的一种天然的磷酸化蛋白，占卵黄蛋白的8.0%～11%，由217个氨基酸组成，其中128个氨基酸残基可被磷酸化。PV磷酸化丝氨酸残基排列连续，构成丝氨酸簇，此结构导致PV深度酶解很困难。许多研究采用部分脱磷酸化后进行酶解，取得了一定成效，但会损失磷酸基团。本团队开发了一种高温中压联合酶解技术，大大改善了PV酶解效果，提高了PPP数量（HTMP-Enz-PPP），从PV中产生多达605个磷酸肽。卵黄高磷蛋白磷酸肽与酪蛋白磷酸肽有相似结构功能，推测其也可以于体内促进钙吸收和沉积，因此本篇论文研究卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙复合物对小鼠钙吸收和骨沉积的影响。

Results and Discussion

当肽与钙的质量比达到7：1时，钙结合率增加到98.44%，表明几乎所有添加的钙都形成了PPP-Ca配合物。样品中的Zeta电位值均为负电荷，说明PV和PPP的表面主要是带负电荷的。当钙结合后，钙离子中和了其表面的负电荷，复合物Zeta电位上升。

图1 肽-钙螯合物的制备及结构表征

通过PV-Ca和PPP-Ca复合物对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性评价了它们的消化稳定性。在模拟胃液中孵育30 min后，PV-Ca的钙保留率为35.48%，相对较低，在孵育6 h内变化不大。PV酶解后形成的HTMP-Enz-PPP具有更好的持钙能力，模拟胃液中的钙保留率在65%～72%，在6 h孵育时间内没有显著变化。

图2 模拟胃肠（pH为2.0的胃）消化对蛋白质/肽钙复合物稳定性的影响

低钙对照组小鼠的骨密度为0.17 g/cm³，显著低于正常对照组（0.29 g/cm³）。补钙4周后，喂养氯化钙小鼠的骨密度仅为0.19 g/cm³，而PV-Ca组和HTMP-Enz-PPP-Ca组的骨密度分别为0.23和0.27 g/cm³。钙沉积和骨密度结果均表明，HTMP-Enz-PPP-Ca在骨再矿化过程中对成骨质量的影响优于无机钙。股骨远端显微CT图像显示，低钙对照组和氯化钙小鼠的股骨中部骨组织疏松，骨小梁结构严重受损。HTMP-Enz-PPP-Ca饲养组股骨整体和股骨小梁与正常对照组相似，表现出紧凑、完整的网络结构，骨小梁较厚，结果表明，HTMP-Enz-PPP-Ca显著改善了骨组织的微结构，提高了骨小梁的完整性。

A. 正常组；B. 低钙对照；C. PV-CaCl2；D. HTMP-Enz-PPP-CaCl2；E. CaCl2

图3 各组股骨远端三维显微CT图像

Conclusion

用高温中压-酶解处理PV制备PPP-Ca配合物，测定其在模拟胃肠道中的稳定性，建立低钙SPF-KM小鼠模型，评价PPP-Ca复合物对骨形成的影响。HTMP-Enz-PPP-Ca喂养后显著降低了钙缺乏引起的血清碱性磷酸酶（AKP）的异常升高，血清钙含量最高，显著改善了骨钙含量和骨密度。HTMP-Enz-PPP-Ca干预的小鼠股骨比低钙和氯化钙组具有更紧凑、完整、致密的骨小梁网络结构。这些结果表明，蛋黄磷酸肽钙复合物能有效促进钙的吸收和骨沉积，效果优于无机氯化钙。

第一作者

赵梦蝶，女，华中农业大学食品科学技术学院硕士。主要研究方向是卵黄高磷蛋白磷酸肽钙复合物的制备及其促钙吸收机制研究。

通信作者

黄茜，华中农业大学教授，博士生导师，食品营养与健康系主任，爱荷华州立大学访问学者，先后任国家一级学会中国畜产品加工研究会副秘书长、理事、青委会委员、亚洲蛋品协会理事。湖北省“青年科技晨光计划”获得者，曾获“中国蛋品加工业杰出青年”称号，华中农业大学“狮山硕彦计划”A类青年英才称号。主持国家自然科学基金3项，国家十三五重点研发计划课题，公益性行业专项子课题、湖北省自然科学基金面上面上项目等十余项。发表SCI/EI论文40余篇。副主编农业部“十二五”规划教材《动物性食品加工学》，参编皇家化学学会英文专著1部和农业部规划教材2部。获国家授权发明专利11项，其中美国、日本、澳大利亚国际专利5项，成果转化1项。获湖北省科技进步一等奖、二等奖。2021年获得美国家禽科学协会（PSA）颁发的American Egg Board Research Award奖。Food Hydrocolloids、Anal. Chim. Acta、Biosens. Bioelectron.、Int. J. Bio. Macr.、Poultry Sci.等SCI杂志审稿人。

Effects of phosvitin phosphopeptide-Ca complex prepared by efficient enzymatic hydrolysis on calcium absorption and bone deposition of mice

Mengdie Zhao^a, Dong Uk Ahn^b, Songming Li^a, Wei Liu^a, Shengwei Yi^c, Xi Huang^a,*

^a National Research and Development Center for Egg Processing, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

^b Animal Science Department, Iowa State University, Ames 50011, USA

^c Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401121, China

*Corresponding author.

E-mail address: huangxi@mail.hzau.edu.cn

Abstract

Phosvitin (PV) was treated with high-temperature, mild pressure (HTMP), and enzyme combination, and then phosvitin phosphopeptides-calcium (PPP-Ca) complexes were prepared. The low-calcium specific pathogen free-Kunming (SPF-KM) mice were used to determine the effect of PPP-Ca complexes on intestinal calcium absorption and their utilization for bone formation. The serum calcium content was the highest with the HTMP-Enz-PPP-Ca treatment (2.19 mmol/L), and it significantly down-regulated the abnormal elevation of serum alkaline phosphatase (AKP) caused by calcium deficiency. The low-calcium control group had the lowest calcium deposited to the femur (80.41 mg/g) and the lowest femur bone mineral density (BMD) (0.17 g/cm³), while HTMP-Enz-PPP-Ca significantly improved bone calcium content (94.33 mg/g) and BMD (0.29 g/cm³). The micro-computed tomography (MCT) images showed that the femur with the normal control, PV-Ca, and HTMP-Enz-PPP-Ca treatments had a more compact, complete, and thicker trabecular network than the low-calcium and CaCl2 treatments. These results indicated that the organic calcium (HTMP-Enz-PPP-Ca) promoted calcium absorption and bone deposition, and the effect of HTMP-Enz-PPP-Ca was better than the inorganic CaCl2.

Reference:

ZHAO M D, AHN D U, LI S M, et al. Effects of phosvitin phosphopeptide-Ca complex prepared by efficient enzymatic hydrolysis on calcium absorption and bone deposition of mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(6): 1631-1640. DOI:10.1016/j.fshw.2022.06.022.

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