刘洪章教授等：玉簪多糖对细胞氧化应激损伤的保护作用机制

2022-11-25 15:04:09

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氧化应激是指机体内氧化失衡的状态，亦是肝损伤发生的主要诱因。氧化应激现象发生时，产生过量的氧自由基会对细胞造成破坏，导致氧化应激损伤。研究表明，活性氧（ROS）是氧正常代谢过程中的产物，也是诱发氧化应激的重要物质，过多的ROS能够影响基因组的稳定性，导致多种慢性疾病发生。

紫萼玉簪又名紫花玉簪，为百合科（Liliacea）玉簪属（Hosta）多年生宿根草本植物，其全草或根均可入药，具有可食用性。目前已有研究证实玉簪中黄酮、皂苷和多糖等成分具有一定的抗炎抑菌活性，但鲜有关于紫萼玉簪根系多糖（HVRP）的抗氧化机制研究。吉林农业大学食品科学与工程学院的吴金姗、刘回民*和吉林农业大学生命科学学院的刘洪章*等旨在探寻HVRP对叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的HepG2细胞氧化应激损伤的影响，在细胞水平解析HVRP的抗氧化作用机制，为HVRP在功能性食品领域的应用提供理论参考。

1、单因素试验结果

料液比、提取温度和提取时间对多糖提取率的影响如图1所示，当料液比为1∶30时，提取率达到最大；随提取温度的升高，提取率先增加后下降，80 ℃时提取率达到最大；随提取时间延长，提取率先增加后下降，在2 h时提取率最大。当提取温度超过80 ℃、时间超过2 h时，多糖受到持续高温的影响会分解，从而导致提取率降低。

2、响应面优化试验分析结果

响应面试验设计与结果分析

根据表3的结果，利用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型方程：Y＝24.44+1.21A+0.46B+0.55C+1.35AB-2.77AC+0.78BC-3.15A²-0.55B²-2.12C²。

二次模型回归统计分析结果如表4所示，回归模型高度显著（P＜0.000 1），失拟项P＝0.879 6，决定系数R²＝0.993 4，校正后R²Adj表明回归方程的拟合度良好，试验方法有较高可信度，可用该模型来分析和预测多糖的提取条件。由F值可知，各因素对HVRP提取率的影响程度为提取温度＞料液比＞提取时间。

最佳提取工艺的确定及验证

模型分析HVRP最佳提取工艺条件为提取温度83.63 ℃、提取时间2.92 h、料液比1∶30.60，预测提取率24.9%。根据实际情况调整工艺为提取温度84 ℃、提取时间3 h、料液比1∶31，HVRP提取率为23.9%，误差1%，表明该模型可行性较高。

3、HVRP理化性质

经脱脂、脱蛋白处理后HVRP提取率为9.29%。测得HVRP中还原性糖的质量分数为11.17%（111.66 mg/g），蛋白质量分数为0.6%（5.96 mg/g），糖醛酸含量较高，质量分数为12.31%（123.12 mg/g）。研究表明，利用咔唑法测定东北玉簪多糖中的糖醛酸质量分数为20.36%～52.76%；百合多糖中糖醛酸质量分数达12.89%。

4、HVRP结构特征分析结果

由图2A可知，HVRP的红外光谱在3 422 cm^-1处有1 个强吸收峰，是由O—H伸缩振动引起的；2 916 cm^-1处吸收峰为C—H伸缩振动；1 745、1 634、1 446 cm^-1处吸收峰为C＝O对称和不对称拉伸振动引起，表明HVRP中存在糖醛酸，与理化分析结果一致；1 088 cm^-1处的吸收峰为吡喃环的醚键所引起，表明HVRP可能为吡喃糖；813、614 cm^-1处的吸收峰表明其可能含有α型糖。

如图2B所示，随着NaOH浓度增加，HVRP与刚果红试剂作用后的最大吸收波长不断减小，较刚果红未发生红移，最大吸收波长的连续下降可能是因为HVRP在水溶液中为无规卷曲构象，且氢键不断被碱性溶液破坏。由此判断，HVRP不存在三螺旋构象。

5、HVRP的体外抗氧化活性

由图3可知，随HVRP质量浓度增大，其抗氧化活性先升高后趋于稳定，呈一定的剂量效应关系，在HVRP质量浓度为100 μg/mL时，DPPH自由基清除率为63.93%，羟自由基清除率为70.31%，超氧阴离子自由基清除率为83.45%。HVRP表现出较强的体外抗氧化能力，其抗氧化活性可能与HVRP中含有一定的糖醛酸有关。

6、HepG2细胞存活率

采用MTT法检测HVRP的细胞内毒性，如图4A所示，0～100 μg/mL HVRP对HepG2细胞的生长无毒性，当质量浓度为200 μg/mL时，HepG2细胞活力受到抑制。因此，选取5、25、100 μg/mL进行细胞实验。

为了考察HVRP对肝细胞氧化损伤的作用机制，采用t-BHP建立氧化损伤模型。如图4B所示，HepG2细胞活力随t-BHP浓度的增加明显下降。通过GraphPad Prism 7.0软件进行拟合，得到t-BHP作用的半抑制浓度（IC50）为（217.52±20.94）μmol/L。因此，选取浓度220 μmol/L的t-BHP建立细胞氧化损伤模型。

7、HVRP对氧化损伤细胞抗氧化能力的影响

由图5A可知，t-BHP作用于HepG2细胞后，ROS生成量是正常组的4.65 倍。HVRP处理能够极显著降低ROS水平，HV100组ROS水平降低至正常组的1.27 倍。如图5B～F所示，与模型组相比，HVRP能显著或极显著降低MDA含量，显著或极显著提高SOD、CAT和GPx活力并增加GSH含量。以上结果说明HVRP能够通过提高氧化损伤细胞的抗氧化酶活力、降低ROS水平来帮助细胞抵御氧化损伤。

8、HVRP对氧化损伤细胞中Keap1/Nrf2/ARE信号通路基因表达量的影响

由图6可知，与模型组相比，HVRP处理总体上可明显上调氧化应激通路中GST、HO-1、NQO1、JNK、Keap1、Nrf2基因的表达，当HVRP处理质量浓度为25 μg/mL时，以上基因的表达量极显著上调，其中抗氧化信号通路下游基因GST、HO-1、NQO1表达量分别为模型组的4.36、4.67、5.28 倍。

9、HVRP对氧化损伤细胞中Keap1/Nrf2/ARE信号通路蛋白表达量的影响

为进一步验证HVRP的抗氧化作用机制，采用Western Blot检测相关蛋白表达情况，与基因表达结果相似，HVRP组较模型组明显提高了Nrf2/ARE通路下游NQO1、HO-1蛋白表达水平（图7A）。

Nrf2的核转移是诱导NQO1和HO-1表达的关键步骤，HVRP处理使细胞质内Nrf2水平呈剂量依赖型降低趋势，而细胞核内Nrf2水平呈剂量依赖型升高，表明HVRP能促进Nrf2的核转移（图7B）；与模型组相比，HVRP处理提高了Nrf2/ARE通路上游激酶p-JNK/JNK水平（图7C）。上述结果与文献[32]结果相似，提示JNK磷酸化可能会促进Nrf2核转移，从而调控Nrf2/ARE通路下游II期解毒酶NQO1和HO-1的表达。

结论

本实验优化了HVRP提取工艺，得到最优提取条件为：提取温度84 ℃、提取时间3 h、料液比1∶31，该条件下HVRP提取率为23.9%。体外抗氧化实验表明HVRP具有较强的自由基清除活性。抗氧化机制研究证明了HVRP通过激活氧化应激Keap1/Nrf2/ARE信号通路起到保护HepG2细胞免受t-BHP诱导的氧化损伤作用。综上，本研究可为HVRP作为天然抗氧化剂在功能性食品中的开发应用提供科学依据。

01 通信作者

刘洪章 教授，中共党员，博士，吉林农业大学生命科学学院博士生导师，曾任园艺系主任、中药材学院院长、生物技术学院党总支书记、生命科学学院院长。吉林省重点学院和吉林省优势特色重点学科带头人、吉林省优秀教学团队带头人、吉林省特色专业带头人、国家精品视频公开课《长白山特色植物资源》主讲人和吉林省精品课程《生物资源学》主持人、吉林省果树品种审定委员会主任和长春市园艺学会理事长等职。创立了“作物资源学”博士授权学科，主建了吉林农业大学第一个理学一级学科“生物学”硕士授权学科并将其建设成为了吉林省重点学科；主讲本科生课程《生物资源学》和《现代农业与技术概论》和研究生的《生物试验设计与统计分析》及博士生的《作物资源学》和《生物资源多样性及其保护》等课程，主要从事长白山特色园艺植物资源及生物技术研究，主持国家科技部、农业部和吉林省科技厅课题十余项，发表学术论文150余篇，主持选育新品种8个，培养硕士和博士研究生八十余人，主编教材和著作12部；获得吉林省科技进步一、二、三等奖7项和吉林省教学成果二、三等奖5项，被评为吉林省师德先进个人、长春市师德标兵和第七届吉林省高等学校教学名师。

刘回民 副教授，中共党员，博士，吉林农业大学食品科学与工程学院硕士生导师。主要从事分子营养和食品化学领域的研究工作，在天然植物活性成分的分离提取、功能研究和递送方面取得了系列创新性成果。主持承担国家十三五重点研发计划子课题、吉林省自然基金项目等国家、省部级项目6项，在Journal of Agriculture and Food Chemistry, Food Chemistry, Food & Function, Nutrients, Food Control, 食品科学等国内外学术期刊发表论文40余篇，获得省部级科研奖励8项，副主编教材1部。担任 Journal of Agricultural and Food Chemistry, Food Research International, Phytomedicine, Food & Function, Journal of Functional Foods等国际期刊审稿人。

02 第一作者

吴金姗，中共党员，吉林农业大学食品科学与工程学院2020级硕士研究生，研究方向为食品科学与功能性食品。以第一作者身份在 International Journal of Biological Macromolecules（JCR2区）发表SCI论文一篇，多次获得研究生学业奖学金及优秀研究生干部等荣誉称号。

本文《玉簪多糖对细胞氧化应激损伤的保护作用机制》来源于《食品科学》2022年43卷17期138-146页，作者：吴金姗，黄榕，刘树英，刘回民，刘洪章，刘景圣。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210602-026。

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