《食品科学》、JFF与FSHW编委—福州大学汪少芸团队：冷水鱼明胶和银耳多糖的相互作用

2023-01-09 16:27:12 FSHW

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Highlights

分析了鱼明胶（FG）和银耳多糖（AP）之间的相互作用
在质量比为1:1和pH值为4.0的浊度下，发生了最大的络合反应
复合凝聚物的形成主要是由静电驱动的
FG-AP复合凝聚物显示出多孔的网络结构
FG-AP复合凝聚物具有较高的表观黏度

Introduction

明胶是蛋白质-多糖复合凝聚物的基本材料之一，是胶原蛋白的水解物，可以从哺乳动物和鱼类中提取。众所周知，哺乳动物明胶在新疾病方面有其局限性，如朊病毒病和口蹄疫，不能满足穆斯林和犹太人的需要。因此，鱼明胶（FG）作为哺乳动物明胶的替代品显示出了优势。然而，由于羟脯氨酸和脯氨酸含量低，它在糊化、流变性和稳定性方面的功能较差。为了克服这些问题，一些研究提出了鱼明胶可以通过酶（MTGase、酪氨酸酶和漆酶）、化学（磷酸化、醛、酚类反应）和物理（电解质或非电解质物质和机械处理）方法进行改性的想法。其中，多糖与鱼明胶混合被认为是一种有前途的方法。蛋白质-多糖复合物有很多应用，例如，脂肪替代、乳剂和生物活性封装等。

一般来说，蛋白质-多糖复合物的形成可以通过浊度滴定来监测，这可能受到pH值、蛋白质/多糖比例、生物聚合物总浓度和离子强度的影响。蛋白质-多糖复合物可以对其物理化学性质产生影响。

人们更关注鱼明胶-多糖复合物的流变学特性，特别是黏度，这是明胶最重要的商业指标之一。有研究提到，通过添加天然黏液，如黄原胶、阿拉伯胶和κ-卡拉胶，可以明显改善鱼明胶的黏度。

从银耳中获得的多糖被命名为银耳多糖（Tremella polysaccharides，AP），它在保湿、糊化、免疫、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂等方面具有许多物理特性和生理功能。最近，有几项工作报告了基于AP和其他蛋白质（包括乳清蛋白分离物和玉米醇溶蛋白）的新复合凝聚物。然而，鲜有关于FG-AP混合物相互作用行为的报告。此外，随着蛋白质-多糖复合凝聚体系的改变，其机制也有所不同。因此，有必要研究FG和AP之间的相互作用机制。福州大学的冯佳雯、汪少芸*、施晓丹*等通过比浊法评估FG和AP之间相互作用的可能性，包括pH值、蛋白质-多糖比例、生物聚合物总浓度，以及添加剂类型和浓度的影响。此外，一些分析技术被用来描述FG-AP凝聚物的结构和理化性质，包括荧光测量、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、差示扫描量热法（DSC）、扫描电子显微镜（SEM）和流变学测试。

Results and Discussion

影响水溶液中FG-AP相互作用的因素

pH值的影响

pH值在蛋白质和多糖复合物的形成中起着重要作用。电荷平衡主要是由于环境条件的pH值，进一步导致了静电作用的强度。在图1A，B中，观察了从pH 2.0到pH 8.0的浊度和Zeta电位的测定。作为对照，纯FG溶液的浊度在所有pH条件下都保持一个恒定的低值。然而，由于自聚集，AP在pH 4.0时显示出一个小的峰值。此外，FG-AP复合物的吸光度值始终高于FG和AP的吸光度值，并且基本上依赖于pH值。根据先前的报告，确定了四个临界pH点（pHc、pHφ1、pHopt和pHφ2）。

如图1B所示，在pH 7.0左右观察到FG的pI，而AP始终带负电荷。在pH＞pHc（7.0）时，FG-AP复合物的浊度保持稳定。这一现象表明，FG和AP之间的相互作用可能很弱，这与它们的负电荷有关。当pH值等于pHc（7.0）时，由于它们的电荷相反，可溶性复合物产生。当pH值下降到pHφ1（6.0）时，随着不溶性复合物的出现，浊度显著增加。在pH 4.0（表示为pHopt）时，浊度达到最大，这是因为大量不溶性络合物的出现。这一趋势可归因于FG-AP复合物中的中和电荷。此后，随着pH值的降低，浊度急剧下降，这表明不溶性复合物开始解离。当pH＜φ2（3.0）时，由于静电吸引的终止，浊度值较低且恒定。

生物聚合物比例的影响

影响复合物形成的另一个关键因素是FG-AP比例。根据图1C，无论蛋白质的含量如何减少或增加，有利于FG-AP复合物形成的最大浊度是FG和AP的比例为1∶1。这一结果表明，每条多糖链为每种蛋白质提供了足够的结合位点，使其相互结合。此外，增加AP的比例使浊度曲线峰移向高pH值，而增加FG的比例使曲线峰移向低pH值，这是由于FG表面存在更多的正电荷。当FG-AP复合物过量时具有更多的正电荷，这意味着pH值必须移动到较高的值以吸引AP的负电荷。

生物聚合物总浓度的影响

总生物聚合物浓度的变化也会影响复合物的过程。不同浓度的FG-AP复合物产生了类似的浊度曲线，在图1D中，其最大浊度为pH 4.0。然而，当生物聚合物浓度过低时，临界pH值很难区分。随着浓度的增加，浊度有增加的趋势，这可以解释为不溶性复合物在高浓度下有很好的机会形成。这一结果与之前的讨论一致，即生物聚合物的总浓度是一个重要的影响因素。然而，在其他研究中发现了相反的观察结果，有报道称浊度值在总浓度为0.75%时处于峰值。赞成这种现象的观点是，反离子的释放筛选了电荷，这可能导致溶解度的增加。

添加剂类型和浓度的影响

通过添加盐、尿素和十二烷基硫酸钠（SDS）等不稳定剂，研究了FG-AP复合物的相互作用力。图1E中所有的浊度都随着添加剂浓度的增加呈现出下降的趋势，加入SDS后的浊度急剧下降。含有二价离子的FG-AP复合物比单价离子的浊度下降更多，而含有尿素的复合物则下降缓慢。盐类离子、SDS和尿素可以分别起到静电屏蔽、破坏静电和疏水相互作用，以及干扰氢键的作用。因此，静电作用、疏水相互作用和氢键可以起到诱导FG和AP之间形成复合物的作用，其中静电作用是主要力量。

荧光光谱分析

图2显示了FG和FG-AP复合物在pH 4.0和7.0时的荧光光谱。蛋白质与多糖的相互作用是通过荧光光谱来研究的，它可以检测蛋白质内在荧光的变化。一般来说，鱼明胶中两个有效的内在荧光团是酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。然而，Phe的光致发光量子产率低，因此Tyr是荧光的主要力量。当在FG中加入AP时，荧光强度表现出下降，并伴随有红移，这意味着局部微环境的特殊性变得亲水性略高，FG-AP复合物可以通过静电相互作用成功形成。

不同条件下形成的复合凝聚物的特征

在上述研究中，光谱技术被用来说明FG和AP在水溶液中的相行为和相互作用机制。结果显示，它们最强的络合作用发生在pH4.0时，因此，络合共沸物被冷冻干燥并收集起来。此外，还收集了在pH3.5、pH3.0和pH7.0时形成的FG-AP络合物。四个样品被应用于SEM和旋转流变仪测试。

微观结构特征

通过SEM对不同pH值的FG-AP凝聚物的微观结构进行了表征。如图3所示，在pH值为3.0、3.5和4.0时，FG-AP凝聚物的形状为多孔网状结构，而在pH 7时则表现为片状结构。此外，在pH 3.5时形成的凝聚物比pH 3和pH 4时的凝聚物更加紧密。网状结构是FG和AP之间静电吸引的结果。它们之间的相互作用越强，形成的网络结构越密集。

流变学特性

图4A显示了不同pH值下FG-AP凝聚物的黏度，表明所有凝聚物的黏度都随着0.1到1001 s^-1的剪切率而降低，表明典型的剪切稀化流动行为。可以发现FG-AP凝聚物在pH 3.5时具有最大的黏度。正如先前的研究报告，蛋白质和多糖之间的静电作用强度与它的黏度高度相关。因此，在pH 3.5的FG-AP凝聚物，即电中性，可以形成更紧密的结构。

此外，在图4B中观察了不同pH值下的黏弹性能。首先，在线性黏弹性区域（LVR）进行了应变扫描实验，将应变设置为0.1%。除了pH 7.0时的FG-AP凝聚物外，其他样品的储能模量（G′）和损耗模量（G′′）占优势，没有交叉点，表现出弹性凝胶状行为。在pH 3.5时的FG-AP凝聚物中，G′和G″达到最高值，这归因于紧凑的网络结构。这一结果与黏度和微观结构的结果相一致。

根据上述数据，在一定浓度的FG和AP下，FG和AP之间最强的相互作用发生在pH 3.5。进一步分析比较了在pH 3.5时形成的FG-AP凝聚物的结构和热性能。

在pH 3.5时形成的FG-AP凝聚物的结构和热性能

FTIR分析

使用FTIR光谱表征样品的官能团和分子结构。在图5A中，FG的特征峰出现在3290 cm^-1（酰胺A，O-H和N-H拉伸），2932 cm^-1（酰胺B，CH2不对称拉伸），1634 cm^-1（酰胺I，C=O拉伸），1530 cm^-1（酰胺II，N-H弯曲和C-N拉伸），以及1235 cm^-1（酰胺III，C-N拉伸、N-H弯曲和CH2摇摆振动）。在AP光谱中，3335和2921 cm^-1左右的峰值分别与O-H和C-H的拉伸振动带有关。同时，1602和1412 cm^-1的吸收峰包括COO-的不对称和对称拉伸振动。此外，在1025 cm^-1的频段来自C-O-C或C-O-H基团的振动。这些峰值表明AP中存在糖醛酸。特别是800 cm^-1对应的是甘露糖残基。与单独的AP相比，可以看出FG-AP凝聚物在3292 cm^-1处的峰值向低波数侧转移，即从3335 cm^-1到3292 cm^-1。然而，与FG相比，其峰值接近于FG-AP。这可能是由于FG和AP之间形成了氢键，或者蛋白质可能在FG-AP凝聚物中占相对较高的比例。此外，FG-AP凝聚物的1235、1602和1412 cm^-1的峰消失，证实了与明胶氨基和多糖羧基之间的静电相互作用。

X射线衍射分析

通过X射线衍射检测了FG、AP和FG-AP凝聚物中的结晶结构和尺寸，结果如图5B所示。所有样品的X射线衍射图都显示出宽的衍射峰，表明它们是无定形聚合物。AP的衍射峰位于8.78°。FG的两个衍射峰在6.76°和20.51°。FG-AP凝聚物在9.04°和19.81°有两个宽的峰，与FG所示相似，这与明胶的三螺旋结构有关。此外，FG-AP凝聚物的X射线衍射峰的强度高于FG，支持FG和AP之间成功形成复合物。

DSC分析

图5C显示了FG、AP和FG-AP凝聚物的DSC曲线。在AP中没有吸热峰，这表明多糖的热稳定性非常好。相比之下，FG和FG-AP凝聚物的吸热峰分别在81.6 ℃和78.9 ℃观察到。变性温度值随着AP的加入而降低，证明了FG和AP之间的静电作用。

通信作者简介汪少芸教授

福州大学生物科学与工程学院执行院长

福州大学海洋科学技术研究院院长

汪少芸，博士、二级教授、博士生导师，福州大学生物科学与工程学院执行院长，美国威斯康星大学（UW-Madison）和加州大学戴维斯分校（UC-Davis）博士后，入选国家“万人计划”科技创新领军人才、科技部中青年科技创新领军人才、省A类高层次人才、省高层次创新人才、省科技创新领军人才。兼任中国食品科技学会理事、福建省健康工程学会副理事长、福建省食品科技学会副理事长，《Food Science and Human Wellness》、《Journal of Future Foods》、《Hans Journal of Food and Nutrition Science》、《食品科学》、《食品工业科技》编委，《Food Science of Animal Products》科学主编，《中外食品技术》首批翻译专家。主持省部级以上项目30余项，编写著作8 部，授权发明专利69 件，发表学术论文300 篇，其中SCI/EI收录230 篇。主持的成果获国际ICOFF学术大会奖、中国产学研合作创新成果一等奖、全国食品产学研优秀科研成果一等奖、中国化工联合会科技进步一等奖、省科技进步一等奖、省科技进步二等奖、省自然科学二等奖。获宝钢优秀教师奖、省优秀教师奖、省优秀科技工作者奖、卢嘉锡优秀导师奖和教学名师奖。受邀担任教育部“长江学者”特聘教授和国家自然科学基金杰青/优青项目的评审专家。

Interaction between fish gelatin and tremella polysaccharides from aqueous solutions to complex coacervates: structure and rheological properties

Jiawen Feng, Han Tian, Xu Chen, Xixi Cai, Xiaodan Shi*, Shaoyun Wang*

Institute of Food and Marine Bio-Resources, College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou, 350108, China

*Corresponding authors.

Abstract

In the food industry, there has been a debate about the interactions between fish gelatin and polysaccharide with the interaction mechanism in different solute and solvent systems still unclear. This article tries to explore interactions between fish gelatin (FG) and Tremella polysaccharides (AP) by the turbidity titration. Especially, the turbidity was greatly influenced by pH, polymer ratio, total polymer concentration, and ionic strength. Optimally, the most complex coacervates could be electrostatically formed at a mass ratio of 1:1 and pH 4.0, which was collected for subsequent characterization. In addition, there was a positive correlation between the turbidity and the total concentration, while the ionic strength was just reverse. Modern instruments including FTIR, XRD, DSC, SEM and rotational rheometer were adopted to characterize the complex coacervates formed at different pH. Results showed that the FG–AP complex coacervates showed porous network structure and had the strongest apparent viscosity with viscoelastic modulus at pH 3.5. These results suggested important implications in how we make a good alternative for fat in food dairy.

专题专栏