FSHW | 红景天多糖的纯化、结构表征及体外抗肿瘤作用

2023-01-17 20:42:16

1989

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Introduction

红景天是一种多年生的草本植物，广泛生长于西藏等海拔比较高的苦寒之地，是一种药食同源两用植物。由于自然资源的局限性和采集方式的限制性，对红景天中有效成分的分析及利用显得尤为重要。最初时期红景天被认为具有清热解毒、提神醒脑、中风偏瘫、倦怠气喘等作用，特别适合高原缺氧人员及中老年人食用。现在常作为药食同源植物应用于食品或化妆品领域，具有许多生理活性。据报道，红景天中富含多种生物活性物质，多糖是红景天的主要生物活性成分之一，它是一种天然的大分子。通常，多糖的生物活性与其提取方式有关，也与其分子大小、单糖成分、糖苷键特征等化学性质有关，不同的结构特征对其活性影响较大。

肝细胞癌是现如今最为常见的原发性肝癌，是一种肝细胞恶性肿瘤。红景天多糖具有多种较好的生物活性，其中，有报道称红景天多糖对s-180肉瘤小鼠具有免疫调节及抗肿瘤活性，并且增加了血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ的产生以及外周血T淋巴细胞中CD4⁺/CD8⁺的比值。低温提取过程虽然相对复杂耗时，但很温和并保持生物活性。

因此，在本研究中，天津科技大学的Yaru Wu，Huiping Liu采用低温的方式从红景天中分离纯化出了一种水溶性均一多糖RLP，对其结构特性进行了表征分析。并建立了H22荷瘤小鼠模型，尝试探索红景天多糖可能的抗肿瘤机制。该研究为红景天多糖的结构和生物活性提供了可能的相关性，并为红景天作为新的天然抗肿瘤药物提供了新思路。

Results and Discussion

红景天多糖的分离纯化

本研究以红景天为原料，经4 ℃水提醇沉脱蛋白后得到粗冷水可溶性多糖cRLP。cRLP粗多糖的得率为2.58%。通过Sephadex G-200纯化，收集组分冻干后得到均一组分RLP。经检测RLP总糖含量为（92.35±0.21）%，糖醛酸含量为（27.68±0.45）%，表明RLP为酸性多糖。图1A为RLP的紫外全波长扫描图。由紫外可见光全波长扫描光谱可知，RLP在260 nm和280 nm处均无明显的吸收峰，说明其不含或含有少量蛋白质和核酸类物质。图1B为RLP的HPGPC光谱，可知RLP在9.211 min处有一明显的单一对称峰，说明RLP是高纯度的均一多糖。结合出峰时间计算RLP的分子量为1.15×10⁶ Da。

（A）紫外图谱；（B）HPGPC图谱；（C）傅立叶红外图谱。

图1 RLP的分离纯化及组成分析

RLP的红外光谱分析和单糖组成

如图1C所示，RLP在3420.45 cm^-1处有一个很强的主吸收峰，这表明存在O-H拉伸振动。C-H可变角度振动在2960.31 cm^-1和1422.28 cm^-1处相对较弱。1621.58 cm^-1和1740.63 cm^-1处的吸收带主要是因为C=O和COOH的存在。在1260.04 cm^-1和1378.15 cm^-1处的吸收带表明C-H和C-O键的弯曲振动。1200-1000 cm^-1是C-O和C-C拉伸振动的特征。1149.23 cm^-1、1077.34 cm^-1和1024.68 cm^-1处的三个信号峰表明RLP中吡喃糖的存在，分别代表了半乳糖，甘露糖和葡萄糖。RLP在917.67 cm^-1和890.28 cm^-1处的吸收峰证明了RLP中既有α构型又有β构型。在890.28 cm^-1和829.31 cm^-1处的特征吸收峰进一步表明RLP含有甘露糖和半乳糖吡喃糖。根据等式A1743.09/（A1743.09 + A1625.11）估算酯化度（DE）值为19％，这表明RLP是低甲氧基化果胶。

图2所示为RLP与混合标准品的单糖组成图，分析表明RLP主要由Rha，Ara，Gal，Glu，Xyl，Man，GalA组成且摩尔比为1：3.33：3.07：5.62：0.49：0.32：4.50，半乳糖和葡萄糖以及半乳糖醛酸含量较高。表明RLP可能是酸性多糖。

图2 单糖标准品与RLP单糖组成离子色谱对比图（1 岩藻糖；2 鼠李糖；3 阿拉伯糖；4 半乳糖；5 葡萄糖；6 木糖；7 甘露糖；8 半乳糖醛酸；9 葡萄糖醛酸）

RLP的核磁共振分析

RLP的¹H和¹³C的NMR光谱如图3A和3B所示。在RLP的¹H光谱中化学位移为δ3.56～5.38是典型的多糖信号特征。当化学位移δ＞4.9时表示α构型，δ4.3～4.9范围内属于β构型，在高场中δ1.37的信号可能来自鼠李糖（残基C）的H-6。但是从图3a中可以看出峰堆叠较为严重，推测可能是由于RLP分子量较大导致其溶解性不好，造成分散性不佳。甲基被归属给鼠李糖C-6。将¹³C信号上δ20.58指定给O-乙酰基上的甲基碳信号。另外，可以观察到化学位移为δ170.70处有一个明显的吸收峰，表明RLP中含有糖醛酸，低场信号被标记为O-乙酰基上的羰基即糖醛酸的C-6，这与上述结果一致。在异头碳区域，δ100和δ100.46的微弱信号表明存在β-D-Man和β-D-Xyl。异头碳C-1信号为δ107.18/5.36和δ107.75/5.26表明存在α-D-Glu和α-L-Araf。δ107.40/4.60处的信号表明存在β-D-Galp，这表明C-4上存在取代基，化学位移将移至低场。鼠李糖在高场区域中的化学位移为δ16.86，这与¹H的结果保持一致。

图3 RLP的一维核磁共振图

红景天多糖对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞及免疫器官指数的影响

如表1所示，在实验期间过程中小鼠体重均有不同程度的增加。随着肿瘤的生长，模型组小鼠体重增加最多，小鼠行动开始迟缓，毛发开始干燥。5-Fu组小鼠体重增加量最少，虽然5-Fu对肿瘤生长有一定的抑制作用，但是对小鼠本身毒副作用也很大，小鼠的毛发脱落。由图4A，4B可知，与RLP剂量组相比，模型组的平均肿瘤重量和体积显著增加。且高剂量组（300 mg/kg）的抗肿瘤作用优于低剂量组（100 mg/kg），抑瘤率分别为45.52%和23.59%，提示RLP口服可有效抑制生长。

另外，从图4C中可知，与空白组相比，模型组的脾脏指数显著增大（P＜0.05），胸腺指数显著降低（P＜0.05）。这是因为H22荷瘤肿瘤细胞严重破坏了小鼠的免疫系统，破坏了免疫器官指数。而经过红景天多糖灌胃后，脾脏和胸腺指数都显著得到了改善，并呈现剂量依赖性。这说明红景天多糖一定程度上会保护免疫器官不受H22肿瘤细胞的袭击。

表1 红景天多糖对小鼠体重及抑瘤率的影

（A）肿瘤重量；（B）肿瘤体积；（C）免疫器官指数。

图4 红景天多糖对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞及免疫器官的影响

红景天多糖对肿瘤细胞周期分布的影响

从图5中观察到，对比于模型组中凋亡期比例3.95%的数据而言，5-Fu组为27.24%，表明5-Fu拥有显著的抑瘤效果。G1/G0期呈剂量依赖性下降，从51.55%（模型组）下降到45.63%（100 mg/kg），41.45%（300 mg/kg）和36.90%（5-Fu组）。G2/M期比例变化较小，从17.23%至6.06%。还可以观察到红景天多糖处理导致S期细胞比例明显上升（P＜0.05＝，从39.2%（100 mg/kg）显著增加到52.65%（300 mg/kg），这表明处于G0/G1期的细胞在进入S期后，不能顺利进入G2/M期，从而不能完成正常的细胞分裂过程，阻止了肿瘤细胞的正常增殖。细胞周期停滞可能是由于DNA复制遭到破坏。这些结果都表明，红景天多糖可以通过在S期阻断实体肿瘤细胞并合成能量和物质来诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的。

图5 红景天多糖对H22荷瘤小鼠实体瘤细胞周期的影响

Annexin V-FITC/PI 检测小鼠实体肿瘤组织细胞凋亡

如图6所示，随着多糖剂量的增加，正常细胞（Annexin V-/PI-）的比例分别从96.6%降至71.7%，31.2%且呈剂量依赖性。此外，肿瘤细胞的总凋亡率（包括早期和晚期凋亡）从2.36%显著提高到57.90%（P＜0.01）。早期凋亡细胞（Annexin V +/PI-）的比例从模型组的2.25%增加到15.4%（多糖，300 mg/kg），晚期凋亡细胞（Annexin V +/PI +）从0.12%增至42.4%（多糖，300 mg/kg）。这些数据进一步证实红景天多糖可以诱导H22细胞凋亡并进一步引起凋亡形态变化。同时，5-Fu组的凋亡率高达51.1%。

（A）流式细胞仪检测H22凋亡细胞比例；（B）细胞凋亡分布百分比。

图6 Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡

红景天多糖对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响

如图7所示，用不同浓度的红景天多糖治疗后，线粒体膜电位呈现剂量依赖性降低，JC-1阳性细胞数从84.6%（模型组）降至68.87%（100 mg/kg）和42.26%（300 mg/kg）。另外与模型组相比，5-Fu中的ΔΨm明显更低。根据结果可以得出结论，红景天多糖可能通过线粒体膜电位途径诱导H22荷瘤小鼠细胞凋亡。

（A）流式细胞术检测H22细胞的JC-1染色直方图；（B）H22细胞线粒体膜电位变化柱形图。

图7 红景天多糖对H22细胞的线粒体膜电位变化的影响

Conclusion

本实验以干燥的红景天根茎粉末为原料，以（4±1）℃的条件对红景天多糖进行提取，随后采用Sevag法脱蛋白、透析、Sephadex G-200等方法对提取的红景天多糖进行纯化，选择目标组分命名为RLP。对RLP进行结构表征、理化性质分析以及体内抗肿瘤活性分析。结论如下：

（1）纯化出的均一组分RLP纯度为（92.35±0.21）%，相对分子量为1.15 × 10⁶ Da，糖醛酸含量为27.68%±0.45%。

（2）RLP是一种含有α和β构型的吡喃糖，且由β-D-Man，β-D-Xyl，α-D-Glu，α-L-Araf和β-D-Galp组成。

（3）红景天多糖可以减轻癌症对脾脏和胸腺的损害，抑制H22细胞的生长（45.52%）

（4）红景天多糖可以诱导H22实体瘤细胞凋亡，阻滞癌细胞的细胞周期于S期。线粒体结果表明红景天多糖可以破坏线粒体膜电位，说明其可能是通过线粒体途径来诱导H22实体瘤细胞凋亡。

第一作者

吴亚茹，天津科技大学2018级硕士研究生，研究方向为动物资源与功能因子。

通信作者

刘会平教授，男，天津科技大学食品学院博士生导师，中国畜牧兽医学会畜产品加工研究会乳品理事，畜产品加工研究会蛋品理事，亚洲蛋品协会理事等。主持和参与课题45项，申请专利63项，现已授权53项，以第一通讯作者发表SCI、EI文章36篇，核心期刊180余篇，获省部级科技进步奖4项，主编和参与13部著作写作。

**A heteropolysaccharide from Rhodiola rosea L.: preparation, purification and anti-tumor activities in H22-bearing mice**

Yaru Wu, Qing Wang, Huiping Liu*, Lulu Niu, Mengyu Li, Qi Jia

State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education of China, College of Food Science and Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

*Corresponding author.

Abstract

Numerous polysaccharides isolated from plants have been used to augment traditional drugs in the treatment of cancer. In order to explore the influence to hepatocellular carcinoma, a novel cold water-soluble polysaccharide was separated from Rhodiola rosea L. root (RLP) and then its structure and anti-cancer activities were tested. The chemical compositions and high performance gel permeation chromatography (HPGPC) results indicated that RLP was an acid heteropolysaccharide with the molecular weight of about 1.15×10⁶ Da. Furthermore, ion chromatography (IC), Fourier transform infrared (FT-IR) and nuclear magnetic resoance (NMR) further indicated that RLP was main composed of →2,4)-α-Rha(1→, →5)-α-L-Araf-(1→, α-D-Glu, →6)-β-D-Galp-(1→, β-D-Man and →4)-α-GalpA-(1→. In vivo antitumor activities of RLP were carried out by using H22 tumor-bearing mice model. The results shown that RLP (100 and 300 mg/kg) could inhibit tumor growth of H22 cells from 23.59% to 45.52% and protect thymuses and spleen without damage. In addition, according to cell cycle, AV-FITC/PI and JC-1, RLP could induce dose-dependent apoptosis of H22 cells via S phase arrested which was through a mitochondrial related pathway. Our data indicated that RLP has a broader application prospect in anti-tumor preparations.

Reference:

WU Y R, WANG Q, LIU H P, et al. A heteropolysaccharide from Rhodiola rosea L.: preparation, purification and anti-tumor activities in H22-bearing mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 536-545. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.056.

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