《食品科学》：郑州轻工业大学白艳红教授等：基于磁性金属有机框架分离的纳米金比色法检测单核细胞增生李斯

2023-05-27 00:13:28

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单核细胞增生李斯特菌是一种常污染动物源食品和低温保藏食品的食源性致病菌，由其引发的李斯特病主要表现为败血症、脑膜炎或自然流产等病症，且致死率高。据2021年欧盟调查显示，全球每10万人就有0.46 人为确诊病例，已经引起广大食品安全行业的高度重视。此外，单核细胞增生李斯特菌具有耐低温特点可在2～4 ℃生长繁殖，是低温食品中的主要致病菌，给食品的贮藏和冷链运输带来困难，严重威胁到人类健康。因此，建立一种灵敏、准确的单核细胞增生李斯特菌检测方法对确保食品安全至关重要。

郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南省冷链食品质量与安全控制重点实验室的杜娟、白艳红*等首先利用磁性金属有机框架材料Fe₃O₄@ZIF-8的超顺磁性和表面吸附作用，使适配体饱和吸附在其表面形成捕获探针（aptamer-Fe₃O₄@ZIF-8，MZ-A），以便捷、高效捕获目标菌并进行磁分离，提高检测的灵敏度；利用目标菌特异性抗体制备免疫AuNPs（Au-Abs@BSA）作为信号探针，通过“适配体-目标菌”和“目标菌-抗体”的双识别作用提高了检测的准确性。建立基于MZ-A和免疫AuNPs的比色检测和紫外光谱检测方法，实现单核细胞增生李斯特菌定性和定量检测，并且评估此法在实际加标样中的应用。

1、Au-Abs@BSA的制备优化

抗体包被缓冲液体系的优化

缓冲液体系是影响AuNPs抗体包被效果的主要因素，选取加入20 μL NaCl溶液（1 moL/L）静置30 min后的颜色变化作为缓冲液体系优化的参考（图2a），AuNPs在溶液中具有稳定性，呈酒红色，NaCl可破坏AuNPs的表面离子结构从而使其发生聚集沉淀。离心后的AuNPs无法重悬于PBS中（图2b），加入抗体孵育30 min后MES中的AuNPs聚集变紫（图2c），进一步加入NaCl溶液后，BB体系中的AuNPs由于抗体的包被增强了AuNPs在溶液中的稳定性（图2d），无聚沉现象保持为酒红色。因此，选取BB（0.01 mol/L，pH 8.0）作为抗体包被AuNPs缓冲液体系。

抗体加入量的优化

如图3a所示，未加入抗体的AuNPs在529 nm具有最大吸收峰，包被抗体后红移至532 nm。如图3b所示，当抗体加入量从1 μL增加为3 μL时Au-Abs在532 nm处的吸光度随着抗体量的增加而减小，但随着抗体量的继续增加，吸光度无明显区别，说明了AuNPs表面偶联的抗体已经达到饱和。因此，选取以500 μL AuNPs中加入3 μL抗体为最优抗体加入量。

BSA封闭量的优化

为保证识别探针的特异性，利用BSA将Au-Abs上多余位点进行封闭，对BSA封闭量进行优化，即测定不同质量浓度BSA封闭后的Zeta电位。结果显示，随着BSA质量浓度的增加，体系中Au-Abs@BSA的Zeta电位也逐渐增加。当BSA封闭液终质量浓度为2 g/100 mL和5 g/100 mL时，Zeta电位无明显差别，说明2 g/100 mL BSA已对Au-Abs进行了饱和封闭（图4）。为达到有较强检测特异性和节约成本的目的，选择BSA终质量浓度为2 g/100 mL为最优封闭液体系。

2、免疫功能化前后AuNPs的表征

如图5a、b所示，AuNPs在扫描电镜下呈小球状，形状均一且分散均匀。透射电镜图进一步显示AuNPs呈椭圆形，颗粒直径在40 nm左右（图5c），AuNPs外表面包裹有一层直径约10 nm的薄膜（图5d），表明抗体成功包被在AuNPs表面。
由图5e可知，AuNPs和Au-Abs在3210 cm^-1和3232 cm^-1附近的宽峰是由于羧基官能团的O—H伸缩振动引起；在2918、2848 cm^-1和2916、2849 cm^-1附近的双峰可归于—CH₂—基团的C—H伸缩振动；1656 cm^-1和1647 cm^-1附近的谱带为—C＝C—基团的双键伸缩振动导致；1400 cm^-1和1398 cm^-1处的峰是甲基C—H面内弯曲振动引起；在1074 cm^-1和1062 cm^-1附近的谱带可归因为环己烷环振动。上述峰均出现在AuNPs和Au-Abs红外光谱图中，且Au-Abs的峰强度较AuNPs明显变弱，表明抗体成功包被在AuNPs表面。
利用马尔文粒度仪测定AuNPs功能化前后的粒径电位结果如图5f、g所示，AuNPs、Au-Abs和Au-Abs@BSA的Zeta电位随着抗体的包被和BSA的封闭，表面正电荷增加导致Zeta电位呈正值增强，分别为（-36.1±0.3）、（-22.3±0.5）mV和（-18.6±0.9）mV，与之前相关报道的结果相同。从粒径分布图也可知，随着抗体的包被和BSA的封闭，AuNPs粒径也逐渐增大，证明了信号探针的成功合成。

3、灵敏度检测结果

如图6a、b所示，本研究所建立的可视化检测方法的检出限为1.2×10³ CFU/mL，线性范围为1.2×10³～1.2×10⁸ CFU/mL。比色法可以更直观地观察检测信号的变化。
利用紫外光谱法进行定量检测，如图6c、d所示，随着单核细胞增生李斯特菌浓度的增大信号探针的紫外光谱强度逐渐减弱，通过对532 nm处吸光度进行拟合，结果表明紫外光谱检测在1.2×10¹～1.2×10⁸ CFU/mL范围内有良好的线性关系，线性方程为Y=0.519-0.043X，R²=0.978。利用检出限计算公式k=3S_b/S（k为检出限，S_b为空白样品的标准偏差，S为标准曲线的斜率）可得通过紫外光谱分析检测单核细胞增生李斯特菌的检出限为0.45 CFU/mL，且各浓度梯度的批内变异系数在0.31%～1.30%之间。与近几年基于MOF材料检测食源性致病菌相比，有较低的检出限。同时，如表1所示，对比本研究方法与以往关于比色法检测食源性致病菌方法，可看出本研究的实验方法相对方便、快捷且检出限较低。

4、特异性检测结果

如图7所示，可视化检测法和紫外光谱法对单核细胞增生李斯特菌的检测为阳性，对其他5 种食源性致病菌在高浓度下（10⁷ CFU/mL）下检测均为阴性，表明该方法的特异性强。

5、实际样品检测结果

选取鸡胸肉进行加标回收实验，结果如图8所示，样品中单核细胞增生李斯特菌从6.7×10⁴ CFU/mL开始出现颜色和灰度值变化，6.7×10⁴ CFU/mL为鸡胸肉加标样的可视化检出限。同时，利用紫外光谱定量的分析了该方法在加标样品中的应用，如表2所示，鸡胸肉中单核细胞增生李斯特菌的加标回收率在91.1%～108.7%之间，变异系数不高于7.4%。此外，采用平板计数法对实验结果进行验证，其回收率在94.7%～105.4%之间，变异系数不高于3.0%，说明本研究建立的检测方法具有良好的准确性。

结论
综上，本实验建立的快速比色法快速、灵敏、准确，为食品安全监管提供风险监测手段，在食源性致病菌检测上具有良好的应用前景。

通信作者简介

白艳红，女，博士，教授，博士生导师，郑州轻工业大学副校长，河南省学术技术带头人，河南省肉品加工与质量安全控制创新型科技团队带头人，兼任河南省冷链食品质量安全控制重点实验室主任，河南省食品科学技术学会副理事长，中国畜产品加工研究会理事，Food Science of Animal Products科学主编，Journal of Food Safety、《食品科学》《肉类研究》《食品质量安全检测学报》编委。主要研究领域为畜产品加工与质量安全控制。发展了原料肉低温等离子体非热杀菌技术与基础研究理论；开发了冷鲜肉类加工安全追溯体系，实现了从养殖到餐桌全程质量安全溯源；研发了具有自主知识产权的原料肉冰温保鲜技术、凝胶肉制品变压耦合乳化成型技术、酱卤肉制品产业化精准加工技术。先后主持承担了国家自然科学基金面上项目、“十三五”国家重点研发计划子课题、河南省重大专项等项目12 项。发表SCI/EI收录论文60余篇，其中ESI高被引论文3 篇；出版著作5 部，其中共同主编国家级规划教材1 部；授权国家发明专利6 件，参与制修订国家、行业标准4 项，获河南省科学技术进步奖二等奖2 项，中国轻工业联合会科学技术进步奖二等奖1 项。

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