冠突散囊菌（Eurotium cristatum）又称“金花”，是散囊菌目、发菌科、散囊菌属的一类真菌。它是茯砖茶生产过程中的优势菌，是形成茯砖茶独特风味的重要因素。据报道，散囊菌属真菌在生长代谢过程中会产生多种具有抑菌活性的次级代谢产物。现代药理研究结果表明，茯砖茶具有降血脂、降血糖、抗辐射、抗氧化等功效。随着“发花”过程的进行，冠突散囊菌孢子开始大量萌发，产生的某些代谢物能够拮抗其他微生物的生长繁殖。

1、不同有机溶剂提取物对抑菌效果的影响

采用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇对冠突散囊菌FS-1冻干菌丝体进行浸提，并减压浓缩得到提取物，3 种粗提物以相同质量浓度（10 mg/mL）进行抑菌实验，其体外抑菌活性如图1所示，乙酸乙酯、石油醚、正丁醇提取物对假单胞菌的抑制率分别为70%、50%、40%左右。根据计算可知，FSEAE对LP-3的半抑制浓度为8 mg/mL。

2、抑菌动力学曲线

如图2所示，对照组恶臭假单胞菌LP-3在8 h进入生长对数期，并于14 h后进入稳定生长阶段。4 mg/mL FSEAE处理处理组生长略微受到影响，而8 mg/mL FSEAE处理后LP-3生长曲线明显低于对照组，说明恶臭假单胞菌LP-3的生长受到了明显抑制。

3、抑菌活性物质的初步鉴定结果

通过LC-QTOF-MS对FSEAE的物质组成进行鉴定，总离子流图如图3所示。结合正离子模式和负离子模式下的质谱数据，通过MassHunter软件对FSEAE的代谢产物进行分析，结果如表1所示，在FSEAE中鉴定出17 种代谢产物。其中，大黄素属蒽醌类代谢产物，曾在谢瓦散囊菌中被发现，该物质可抑制革兰氏阴性菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、副猪嗜血杆菌）和革兰氏阳性菌 （粪肠球菌、金黄色葡萄球菌）。苄基衍生物(E)-2- (庚-1-烯基)-3-(羟甲基)-5-(3-甲基丁-2-烯基)苯-1,4-二醇在匍匐散囊菌中被发现，它能够抑制金黄色葡萄球菌和光滑念珠菌，可应用于预防疟疾。蒽醌类产物灰绿曲霉黄色素与1,5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌发现自冠突散囊菌，其对普通变形杆菌具有明显的抑菌活性。黄曲黄素作为一种新型抗炎症化合物在阿姆斯特丹散囊菌中被发现。

4、FSEAE对恶臭假单胞菌LP-3菌体形态的影响

恶臭假单胞菌LP-3菌体在扫描电子显微镜下的形态如图4所示，未经FSEAE处理的恶臭假单胞菌LP-3细胞完整，呈短棒状，表面光滑，细胞间分隔明显， 边界清晰（图4A）；经过4 mg/mL FSEAE处理后，细胞聚集黏附在一起，结构被破坏，形态变得不规则，表面出现裂纹，部分内容物流出（图4B）；经过 8 mg/mL FSEAE处理后，细胞表面出现囊泡结构，具有更多的膜凹陷，内容物成片流出，并出现部分异常细胞（图4C）。

5、FSEAE对LP-3菌株内容物的影响

如图5A所示，FSEAE处理后的恶臭假单胞菌LP-3 发生了K^＋向细胞外的泄漏，8～16 h对数生长期升高最为显著。8 h时K^＋的泄漏量提升至1 140.52 mmol/g， 16 h时上升至最高。经过FSEAE处理后的恶臭假单胞菌 LP-3菌悬液上清中SOD、GSH-Px和CAT活力总体呈现先升后降的趋势，且在8～16 h的对数生长期达到最高值（图5B～D）。处理后的LP-3胞外MDA含量明显增多 （图5E）。综上，LP-3的细胞膜遭到FSEAE的破坏，细胞膜发生了脂质过氧化，并诱导了细胞内的氧化应激。当氧化应激不平衡而有利于有毒物质积累时，包括蛋白质、脂质、DNA和RNA在内的细胞分子将被不可逆转地破坏，从而可能导致细胞死亡。

6、FSEAE对恶臭假单胞菌LP-3的代谢干预

对3 份恶臭假单胞菌LP-3菌体FSEAE处理组样品和 3 份恶臭假单胞菌LP-3菌体对照组样品进行GC-MS分离检测，共鉴定出124 种代谢产物（图6）。PCA评分结果表明，FSEAE处理组与对照组代谢产物差异较大，离散程度较高（图7）。该模型累计差异解释性（R² _X(cum)） 为0.848，拟合程度较高。

经变量重要性投影值（VIP）分析得到在30 种差异代谢物VIP大于1且P＜0.05（图8）。其中，1,2,4,5-四甲基苯、L-山梨糖、D-阿洛糖、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷、D-苹果酸、 丙酮醇、柠檬酸、1-壬醇、反式卡巴酸、硬脂醇环氧化 物、苏氨酸、乙酰异丁香素12 种代谢物在对照组中表达量相对较高；正缬氨酸、苯醌、苯乙醛、脯氨酸、2,3-二羟基联苯、4-乙烯基苯酚、木酮糖、柠康酸、草酸、2-羟基吡啶、山柰酚、1-十六烷醇、2-氨基辛酸、邻苯二甲酮、甘氨酸-脯氨酸、樱黄素、苯基-β-吡喃葡萄糖苷和甘油这18 种代谢物在处理组中表达量较高。

如图9所示，乙醛酸和二羧酸酯代谢、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和ABC转运蛋白（ATP结合转运过程）富集结果显著（P＜0.05）。根据通路代谢产物聚集分析，其中草酸、柠檬酸在乙醛酸和二羧酸酯代谢中发挥作用；L-山梨酸、D-阿洛糖在果糖和甘露糖代谢中作为前体物质起作用；L-山梨酸、甘油在半乳糖代谢中起作用；脯氨酸、D-阿洛糖和甘油参与了ATP转化过程。结合差异代谢物分析结果，L-山梨糖、D-阿洛糖、柠檬酸在处理组中表达量下调，脯氨酸、草酸、甘油在处理组中表达量上调。主要差异代谢物对恶臭假单胞菌LP-3 功能通路的调控情况如图10所示。

结论

采用乙酸乙酯可更有效地提取冠突散囊菌FS-1胞内抑菌活性物质。以恶臭假单胞菌LP-3为抑菌模型，研究 FSEAE的抑菌机理，基于GC-MS的非靶向代谢组学技术，推测FSEAE主要通过干扰恶臭假单胞菌LP-3 TCA循环中的关键物质（柠檬酸、ATP、丙酮酸）对其生长产生抑制作用，从而导致宏观层面可通过扫描电子显微镜观测到细胞膜的破坏；测定K^＋含量、细胞代谢途径中的关键氧化应激酶系SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含 量，可发现胞内内容物的流出，且抑菌作用发生在恶臭假单胞菌LP-3的对数生长期。本研究从对细菌的代谢干预角度解析了冠突散囊菌的抑菌机理，可为冠突散囊菌的应用提供理论依据。