通过气相色谱-质谱、气相色谱嗅觉、气味活性值、香气重组和遗漏测试对四个石榴汁品种中关键香气化合物

2023-07-24 20:47:36

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Introduction

富含植物营养素的水果由于其促进健康的作用而受到高度需求。石榴（Punica granatum L.）因其抗动脉粥样硬化、抗氧化和抗高血压的特性而在世界范围内广受欢迎。在过去的几十年里，许多石榴品种，如大红天（DP）、京皮天（JP）、鲁玉丹（LP）和天红丹（TP），已在中国西北部的石榴园中得到了广泛的种植。石榴主要以新鲜水果的形式食用或加工成产品，如新鲜果汁、罐装饮料、果冻和果酱。

香气是最重要的品质属性之一，它极大地影响着消费者的感官体验。近年来，人们对石榴的香气进行了越来越多的研究，并成功鉴定了几种香气化合物。尽管已经在石榴中鉴定了大约100种挥发性化合物，但只有有限数量的化合物被认为可能有助于石榴汁整体香气的关键香气化合物。气相色谱-嗅觉（GC-O）分析和气味活性值（OAV）已成为鉴定关键香气化合物的有效工具。通过使用气相色谱-质谱（GC-MS）、GC-O和OAV，分别鉴定出19种和22种化合物为榴莲果实和柑橘中的关键香气化合物。将这些化合物从原始果汁系统中单独分离出来，随后进行分析。然而，这种方法没有考虑气味的感知相互作用，如拮抗、抑制和协同作用。这些化合物只能代表单一化合物的香气，而不能代表果汁的整体香气。在这种情况下，有必要通过从香气模型中消除单个化合物或一组化合物，来验证挥发性化合物的香气贡献，并为其排序。

即使对石榴的香气进行了广泛的研究，但对石榴汁中的关键香气化合物的系统研究仍然缺乏。本研究的目的是（i）通过定量描述分析（QDA）和气相色谱-质谱分析（GC-MS）选择一个非常受欢迎的石榴汁品种；（ii）通过GC-O和OAV鉴定广受欢迎的石榴品种中的关键香气化合物；（iii）通过香气重组和删除实验来验证关键的香气贡献者。本研究可能揭示出石榴汁中的关键香气化合物，这有助于改善石榴汁的风味。

Results and Discussion

石榴汁的感官概述

采用QDA对4个不同品种石榴汁的香气特征进行了综合评价。经过培训的小组成员获得了七个描述符，即花香、果味、甜味、木质、泥土味/霉味、绿色和整体喜好。如图1所示，1、4个样品具有相似的香气特征，但香气强度不同。品种、成熟度和贮藏可能是影响水果香气的主要因素。花香、果香和木香的香气强度高于其他3种香气，表明它们有可能成为石榴汁中的主要香气。在4个品种中，DP以花香为特征，得分为2.5，其次是甜味（1.5）、木质（1.5）和果味（1.5），而泥土味较低。总的来说，DP样本比其他品种表现出最高的整体好感度。

图1 石榴汁通过QDA的感官图谱

四种石榴汁样品中挥发性化合物的定性定量分析

通过HS-SPME提取每个石榴汁样品中的挥发性化合物，并通过GC-MS进行分析。然后使用Mass Hunter软件（MS）中的统计比较函数对挥发性化合物进行初步测定。将通过正构烷烃系列计算的实验RI与报告的保留值进行比较（报告的保留数值引用自http://webbook./nist.gov/chemistry)。为了进一步验证挥发性化合物的分析结果，在相同的分析条件下使用了一些高纯度的GC-MS商业标准品（St）。如表1所示，DB-WAX和DB-5分别鉴定了43种和23种挥发性化合物。然而，根据优化的实验，与DB-5相比，DB-WAX柱更适合鉴定石榴汁中的挥发性化合物。

表1 石榴汁中极性柱和非极性柱挥发性化合物的鉴定

如表2所示，挥发性化合物分为5个不同的化学类别，其中醇类（17）和萜烯类（14）是石榴汁中主要的挥发性化合物，其次是醛类（9）、酯类（2）和酮类（1）。在这些化合物中，C6醇（1-己醇和(Z)-3-己烯-1-醇）和C6醛（己醛）被报道为石榴汁中绿色和草香味的不可或缺的贡献者。在定量水平上，1-己醇是含量最高的挥发性化合物，在71.126～210.91 μg/kg范围内，DP的最高值为210.91 µg/kg。有趣的是，1-己醇被准确地鉴定为一种具有香气活性的化合物，在之前的研究中一直在石榴汁中检测到这种化合物。其他数量占主导地位的化合物，β-石竹烯，甜味和木质味，在石榴汁中经常被发现，并一度被GC-O认为是香气活性化合物。

表2 石榴样品中挥发性化合物的平均浓度

四个石榴汁样品的比较（表2）表明，DP中α-石竹烯、苯乙烯、顺式-β法尼烯和γ-萜品烯的浓度远高于其他样品，这可能有助于石榴汁的木质化。JP中的酒精浓度也较高。在这些酒精中，庚醇和萜品烯-4-醇被描述为辛辣/发霉，这与感官结果一致。三种化合物，包括6-甲基-5-庚烯-2-酮、(E,E)-2,4-二烯醛和乙酸乙酯，仅在LP中检测到，但由于阈值较高，它们不能促进整体香气。TP中挥发性化合物的质量和数量较低，可能是由于TP的多样性，表现出较弱的整体香气。其他5种化合物（苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、1-己醇、(Z)-3-己烯醇、(E)-2-癸烯醛）被认为是香气图谱中的有力贡献者。相反，其他化合物的平均浓度较低，包括β-月桂烯（10.641 μg/kg）、1-辛烯-3-醇（3.443 μg/kg）和1-庚醇（3.106 μg/kg），芳樟醇（6.357 μg/kg）以及萘（1.958 μg/kg）使用层次聚类分析（HCA）来证明43种香气化合物之间的相互相关性，以及如何对它们进行聚类以区分石榴汁样品，如图2所示。在区域A、B和C中，挥发性化合物的浓度显著高于其他样品（P＜0.05），挥发性化合物浓度用不同的颜色明显区分。通过真实的标准校准曲线量化的较高浓度的化合物是否对石榴汁的整体香气质量有积极贡献，而较低浓度的化合物则没有，对于这个问题，进行了GC-O和OAVs分析，因为它们可以在样品的整体香气质量中提供更真实的效果。

图2 43种挥发性化合物的热图和HCA聚类结果

通过GC-O分析石榴汁中的芳香性化合物

GC-O是一种配备人类嗅觉仪的方法，已用于分析样品，该方法在识别和排序复杂和混合系统中香气活性化合物的贡献方面非常有用。如表3所示，检测到16种芳香活性化合物，包括萜烯（5）、醇（7）、醛（3）和酮（1）。图3显示了四个样品中香气活性化合物的浓度和强度之间的差异，浓度的热图（图3A）和香气强度的堆叠条形图（图3B）。这些差异清楚地表明了符号的大小和颜色。Kulkarni揭示了萜烯在控制PG风味和整体顾客偏好方面发挥着重要作用。在这些萜烯中，柠檬烯（AI，1～2.9）是所有样品中发现的最具香气活性的化合物。柠檬烯具有柠檬和柑橘的香气，是石榴中的关键香气活性化合物，这与我们的研究一致。木质香气在石榴的香气质量中也起着不可或缺的作用，β-蒎烯（AI，1.5～2.0）和β-石竹烯（Al，0.5～1.8）似乎是最重要的木质香气化合物，因为它们的香气强度适中。

表3 GC-O鉴定了4种石榴汁样品中的芳香活性化合物

图3 通过GC-O对四个品种石榴汁中香气活性化合物浓度的热图（A）；芳香活性化合物的芳香强度的堆积条形图（B）

酒精在各种果汁的整体香气质量中起着不可或缺的作用。据报道，1-辛烯-3-醇由亚油酸和1-戊烯-3-酮形成。它被描述为蘑菇状气味，在所有样品中具有最高的香气强度（AI，2.5～4.6）。两种C6醇，即1-己醇和(Z)-3-己烯-1-醇，通过脂氧合酶途径来源于亚油酸或亚麻酸，在石榴汁中发挥着关键作用，特别是1-己醇（AI，1.4～3.9）具有相对较高的浓度和香气强度。(Z)-3-己烯-1-醇（0.3～2.8）由(E)-3-己烯醛通过醇脱氢酶（ADH）催化，它已被确定为对石榴汁和其他浆果的整体香气有贡献的最主要的挥发性化合物之一。花香是石榴整体香气不可或缺的一部分，芳樟醇似乎是花卉描述符的关键贡献者。有趣的是，芳樟醇（1.0～3.1）是一种在各种水果、蔬菜和饮料中发现的萜烯醇，其浓度较低，平均含量为3.162 μg/kg；然而，由于其气味阈值较低（2.4 μg/kg），它仍然呈现出较高的香气强度。值得注意的是，两种C6醛（己醛和(E)-2-己醛）显示出类似的绿色气味，这些化合物可能被判断为石榴汁绿色香气的关键来源。己醛（AI，0.1～3.2）已被广泛验证为各种果汁中整体香气的关键挥发性物质，特别是被报道为石榴的关键香气活性化合物。(E)-2-己醛（AI，0.3～0.9）总是以微量或少量的形式存在于石榴汁中，其香气与新鲜割草和生水果相似。然而，由于样品中(E)-2-己醛的浓度较低，气味阈值较高，其对绿色气味的贡献相当微弱。

通过OVA分析石榴汁中芳香性化合物

石榴汁中香气化合物的贡献也通过其OAV来确定。先前的研究表明，OAVs≥1的挥发性化合物可以被视为样品整体香气的贡献者。如表4所示，通过GC-O鉴定的16种化合物中有11种超过了各自的气味阈值。值得注意的是，1-辛烯-3-醇的OAV最高（95.2～1706），平均688.65≥100，表明该化合物具有不可或缺的贡献，与GC-O分析的结果一致。1-己醇（绿色，OAV 25.36）、己醛（绿色，OAV 10.14）和壬醛（绿色）（OAV 22.52）的OAV＞10，它们也可以被视为石榴汁中的关键香气化合物。β-月桂烯（OAV 8.6）、(Z)-3-己烯-1-醇（OAV 4.51）、芳樟醇（OAV 4.06）、β-石竹烯（OAV 1.44）和1-庚醇（OAV 1.34）是整体香气的贡献者。其中，1-辛烯-3-醇、1-己醇、(Z)-3-己烯-1-醇、己醛、壬醛和β-月桂烯被证实对石榴有正向作用。其他挥发性化合物（OAVs＜1），包括β-蒎烯、γ-萜品烯、(E)-2-己烯-1-醇和(E)-2-己烯醛，被认为具有较小的协同作用。尽管这4种石榴是陕西最常种植的品种，以满足西北地区对石榴汁的需求。与挥发性化合物的数量、感官评价、香气强度和OAV相比，DP更受欢迎，更适合加工成产品。DP中关键香气化合物的鉴定有助于提高对杀菌过程中关键香气物质转化机制的理解。

表4 四种石榴汁中芳香活性化合物OAV值的比较

芳香重组和删除实验

应用香气重组和删除实验来证实已鉴定的11种具有高OAV的香气活性化合物在DPA的整体香气特征中的不可或缺的作用。使用了完全重组的香气模型，由11种天然浓度的香气活性合物组成，使用84.54%的蒸馏水和15.46%的非挥发性化合物溶液作为基质。

原始DP和重组DP之间的感官评估由经过培训的小组成员进行。如图4所示，没有重组DP和原始DP的感官描述符存在显著差异，表明11种香气活性化合物可以表征DP的整体香气特征。重组DP更倾向于甜味和果味描述符，而花、木质和绿色描述符略低于原始DP样本。此外，重组DP的泥土/发霉描述符与原始DP的相似。当化合物相互作用在一起或与非挥发性化合物相互作用时，这些现象可能受到几种嗅觉相互作用的影响。

图4 DP香气模型（11种化合物，OAV≥1）的香气图谱与原始DP的香气图谱的比较

随后使用省略实验来阐明DP中潜在的关键芳香化合物的贡献。总共使用了13个DP的香气省略模型来进一步研究单个化合物或一组化合物的贡献，这些化合物可以表征整个香气特征。感官小组成员通过三角测试对这些香气缺失模型进行了评估，并将其与完全重组DP模型进行了比较。从16种有效化合物（OAVs≥1）中鉴定出7种关键的香气活性化合物，显示遗漏模型中的差异（P＜0.05）（表5）。特别是，缺乏所有萜烯、β-月桂烯、所有醇、(Z)-3-己烯-1-醇、芳樟醇和1-己醇的模型显示出显著差异（P＜0.001或P＜0.01）。这些发现表明，这些化合物对DP的整体香气具有重要意义。值得注意的是，尽管1-辛烯-3-醇和壬醛在DP中显示出高OAV，但从模型中排除1-辛烯3-醇或壬醛仅导致整体香气特征的微小变化。这可能是由于增强或抑制了关键芳香族活性化合物之间的相互作用。此外，省略柠檬烯、芳樟醇和己醛导致重组DP模型发生显著变化（P＜0.05），根据确定的较高OAV，精确定位了这些化合物对整体香气的关键作用。然而，该模型缺乏β-石竹烯（木质气味）不会影响整体香气，β-石竹烯可能不会被视为DP的关键贡献者。壬醛（有绿色气味）和萘（有柑橘气味）也出现了类似的结果，如模型12和13所示。

表5 完全重组模型的遗漏检验

Conclusion

本研究共对43种挥发性化合物进行了准确鉴定和定量，其中16种挥发性化合物被标记为潜在的香气活性化合物，11种挥发性化合物是重要的高OAV香气活性化合物。将11种香气活性化合物与其原始浓度混合，可以成功地重组石榴汁的香气特征。实验证实，β-月桂烯、1-己醇和(Z)-3-己烯-1-醇是DP样品整体香气的关键香气化合物。此外，柠檬烯、1-辛烯-3-醇、芳樟醇和己醛也是重要的芳香活性化合物。

Characterization of the key aroma compounds in four varieties of pomegranate juice by gas chromatography-mass spectrometry, gas chromatography-olfactometry, odor activity value, aroma recombination, and omission tests

Cong Lu^a, Yuyu Zhang^b, Ping Zhan^a,*, Peng Wang^a,*, Honglei Tian^a,*

^a College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China

^b Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China

*Corresponding authors.

Abstract

Pomegranate (Punica granatum L.) has attracted considerable attention in world markets due to its valuable nutrients and highly appreciated sensory properties. The aroma profiles of 4 varieties of pomegranate juice, including Dahongtian (DP), Jingpitian (JP), Luyudan (LP), and Tianhonngdan (TP), were investigated via gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography-olfactometry (GC-O) analyses. A total of 43 volatile compounds were identified by using GC-MS. Among these compounds, 16 were considered as potential aroma-active compounds as detected by GC-O. These compounds belonged to the classes of terpinenes, alcohols, and aldehydes. Eleven volatile compounds were defined as the main contributors to the overall aroma of pomegranate juice due to their high odor activity values (OAVs ≥ 1). Aroma recombination and omission tests confirmed that β-myrcene, 1-hexanol, and (Z)-3-hexen-1-ol were the key aroma compounds, and limonene, 1-octen-3-ol, linalool, and hexanal were important aroma-active compounds in DP samples.

Reference:

LU C, ZHANG Y Y, ZHAN P, et al. Characterization of the key aroma compounds in four varieties of pomegranate juice by gas chromatography-mass spectrometry, gas chromatography-olfactometry, odor activity value, aroma recombination, and omission tests[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(1): 151-160. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.033.

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