季俊夫副教授：负载辣椒素的巯基改性壳聚糖-玉米醇溶蛋白纳米颗粒制备与稳定性分析

2023-07-24 20:59:39

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辣椒素（CAP）是存在于辣椒中的具有辛辣刺激性的生物碱，因其具有心血管保护、阵痛、抗炎、抗氧化、抗癌、减肥等生物活性功效而广受关注。由于CAP的强刺激性，直接口服可能导致口腔发炎、胃溃疡和胃肠道痉挛。纳米包埋技术是改善CAP口服应用局限性的有效方法。

巯基化聚合物能够与消化道黏液中黏蛋白形成二硫键，已成为最具潜力的缓释材料类别之一。其中巯基壳聚糖（TC）通过对来源于节肢动物甲壳素中的生物多糖壳聚糖进行巯基化改性而来，具有高黏液黏附性、生物相容性以及生物可降解性。玉米醇溶蛋白（Zein）是来源于玉米的醇溶性蛋白。使用TC和Zein构建多糖-蛋白复合递送体系，预期能够结合两者优势，在延缓CAP释放的同时延长递送体系在消化道的滞留时间，以期通过缓释递送改善CAP吸收。

中国农业大学食品科学与营养工程学院尹琬婷、李开鑫、季俊夫*等使用巯基乙酸对壳聚糖进行巯基化改性，再以TC和Zein为壁材、以CAP为芯材，通过反溶剂法制备负载CAP的TC-Zein纳米颗粒（TC-Zein-CAP），利用动态光散射、透射电镜、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱（FTIR）等对最佳条件下制备的纳米颗粒的粒径、形貌和结构进行表征，并探究其pH值稳定性和离子强度稳定性，以及在体外模拟消化过程中的释放特性，从而评价其用于CAP口服缓释的潜力。

1 TC的FTIR分析与巯基含量

通过FTIR光谱对比改性前后的壳聚糖。如图1所示，壳聚糖的特征峰主要包括3 200～3 500 cm^-1处的—OH伸缩振动吸收峰、1 670 cm^-1处酰胺基的吸收峰以及1590 cm^-1处NH2基团的吸收峰。进行巯基化改性后，2 570 cm^-¹处出现巯基的特征峰，且1 630 cm^-1出现改性反应产生的酰胺键对应的C＝O拉伸。由此证明，成功得到巯基壳聚糖。根据Ellman试剂法得到，所得TC的巯基含量为（67.244 6±2.546 7）μmol/g。

2 纳米颗粒壁材比例的确定

为确定最佳纳米颗粒制备工艺，分别按TC-Zein-比例为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4制备TC-Zein纳米颗粒并表征。如图2A所示，纯Zein纳米颗粒粒径为（67.66±0.89）nm，PDI为0.199±0.012。加入TC后，在4∶1、2∶1和1∶1的比例下，粒径分别为（96.41±1.01）、（87.37±0.76）nm和（88.04±1.57） nm，PDI在0.159～0.236范围，表明粒径较小且分布均一。然而，在TC比例增加至1∶2和1∶4后，粒径急剧增加至（454.47±9.71） nm和（1 018.23±29.78） nm。表明在一定浓度范围内增加TC比例不会对粒径产生明显影响，但过多TC的加入会导致粒径显著增大。在4∶1、2∶1和1∶1比例下，澄清而可溶的TC的加入降低了Zein纳米颗粒的浊度（图2C、D），而在TC比例增加至1∶2和1∶4后，样品溶液的浊度也发生了显著增加。但是带正电的TC比例提高却并没有显著改变纳米颗粒的表面电势，可能因为粒径的增加导致了比表面积的减小。纳米递送载体保持较小的粒径有利于发挥其高比表面积的优势，与体内相应位点进行相互作用，从而改善活性物吸收。因此，为确保缓释效果，本研究选择适宜粒径范围内壁材含量最高的比例TC-Zein为1∶1用于CAP的递送研究。

3 负载CAP纳米颗粒的表征

为获得最佳包封效果，设置Zein与CAP比例为40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1进行探究。如表1所示，在Zein-CAP比例为10∶1、5∶1、2.5∶1时粒径相近，均在76 nm左右，且PDI均较小。而在20∶1和40∶1比例下粒径和PDI则显著增大，40∶1比例下粒径达到（100.65±1.39） nm，PDI为0.317±0.026。由此表明，CAP的加入量过低会导致TC-Zein纳米颗粒的粒径增加，均一性变差。所有负载CAP纳米颗粒的Zeta电位值无显著差异。在包封率和载药量方面，40∶1、20∶1和10∶1比例下的包封率分别为（77.12±4.89）%、（68.37±2.13）%和（66.65±4.84）%，显著高于5∶1和2.5∶1组。其中10∶1比例下的载药量最高，达到（36.85±1.22）μg/mg。综上所述，在Zein-CAP为10∶1时所得纳米颗粒的粒径和PDI较小，包封率较好，载药量最高，因此选择该比例条件用于制备TC-Zein-CAP纳米颗粒。

4 纳米颗粒中的相互作用机制

如图3A所示，Zein中的酪氨酸残基使其在280 nm的激发波长下，在278 nm处有强烈的荧光发射峰，加入TC后荧光强度增加。负载CAP后，Zein和TC-Zein纳米颗粒的内源荧光均发生猝灭，而最大发射波长没有发生改变。荧光猝灭的发生证明CAP与Zein能够有效结合，因此TC-Zein-CAP具有较高的包封率和载药量。

通过FTIR分析CAP、Zein和TC三者间的相互作用。如图3B所示，Zein、TC和CAP分别在3 325、3 480 cm^-1和3 291 cm^-1处存在—OH拉伸振动吸收峰，在2 970、2 929 cm^-1和2 924 cm^-1处存在C—H拉伸倾斜吸收峰，在1 666、1 638 cm^-1和1 643 cm^-1处存在C＝O拉伸吸收峰，在1 538、1 514 cm^-1和1 519 cm^-1处存在N—H弯曲吸收峰。此外，TC在1 080 cm^-1处存在C—O—C拉伸对应的特征峰，CAP在1 467 cm^-1处存在芳香环对应的特征峰。在Zein-CAP中，CAP谱图中500～1 643 cm^-1范围的连续吸收峰被Zein的特征峰掩盖。—OH拉伸振动吸收峰迁移至3 317 cm^-1处，表明二者间存在氢键相互作用。C—H拉伸倾斜、C＝O拉伸以及N—H弯曲对应的吸收峰均发生迁移。在TC-Zein-CAP的谱图中，—OH拉伸振动、C—H拉伸倾斜、C＝O拉伸以及N—H弯曲对应的吸收峰也均发生了迁移，表明三者间存在氢键和疏水相互作用。

5 透射电镜

如图4所示，TC-Zein-CAP纳米颗粒为规则的球形，大小均一，粒径为70～80 nm左右，与动态光散射所得结果（（76.05±1.1） nm）一致。纳米颗粒呈现单颗粒分布，表明所选的Zein与TC比例适宜，不会引发颗粒的黏附聚集。

6 纳米颗粒的稳定性评价

如图5A所示，Zein-CAP在pH 3～4以及pH 7～8下粒径较为稳定，但在pH 5～6范围发生严重沉淀，因此粒径不进行检测。而TC-Zein-CAP则在pH 3～5粒径变化较小，维持在106.7～169.1 nm范围。在pH 6～8下粒径则显著增加至362.0～437.5 nm。Zein等电点在pH 6.2左右，因此仅用Zein作为壁材的纳米颗粒在接近其等电点时会由于静电斥力下降而聚沉。TC-Zein-CAP与Zein-CAP相比在pH 5～6下更为稳定，表明TC的加入增强了纳米颗粒的pH稳定性。

图5B结果显示，Zein-CAP对于离子强度的变化非常敏感，在仅50 mmol/L NaCl浓度下粒径迅速增加由（90.8±0.4） nm至（752.7±25.9） nm。在更高的NaCl浓度下Zein-CAP沉淀析出。TC-Zein-CAP在0～50 mmol/L NaCl浓度范围内粒径也随离子强度的增加而增大，由（106.7±0.4） nm增加至（525.8±21.1） nm；在50～200 mmol/L NaCl浓度范围内粒径则略减小至（411.6±4.7） nm。TC的加入显著改善了纳米颗粒的离子强度稳定性。综上所述，TCZein-CAP具有较好的pH值稳定性和离子强度稳定性。

7 纳米颗粒的体外消化释放特性

如图6所示，在胃消化阶段，TC-Zein-CAP和Zein-CAP中的CAP释放率均较小，且随着消化时间的延长并无明显增加。TC-Zein-CAP的释放率保持在18%左右，Zein-CAP的释放率保持在24%左右。TC-Zein-CAP中TC为递送载体增加了物理屏障，进一步限制了CAP的释放。在肠消化阶段，Zein-CAP的释放率迅速增加，30 min内由（24.86±1.20）%增加至（38.57±2.97）%，2 h后最终释放率为（50.12±1.78）%。TC-Zein-CAP的释放率在肠消化1 h内增长较慢，仅由（18.56±0.34）%增至（22.37±1.17）%。但在1～2 h内释放速率明显增加，最终释放率为（40.08±4.28）%。TC-Zein-CAP中TC的存在延缓了Zein的酶解，因此能够实现更好的CAP缓释效果。

结论

通过巯基化改性得到巯基含量为（67.244 6±2.546 7） μmol/g的TC，与Zein复合包埋CAP。最佳制备条件为TC-Zein-CAP为10∶10∶1，能够得到粒径为（76.05±1.06） nm，载药量为（36.85±1.22） μg/mg的纳米颗粒。通过荧光光谱、FTIR以及透射电镜验证纳米颗粒对CAP的包埋效果，结果表明CAP能够与Zein有效结合，通过氢键和疏水相互作用形成纳米颗粒，其形状为规则球形，大小分布均一。与Zein-CAP单层包埋相比，TC-Zein-CAP具有更好的pH值稳定性和离子强度稳定性，在体外模拟消化过程中能够实现更好的CAP缓释效果，消化4 h后释放率仅为（40.08±4.28）%。综上所述，采用TC-Zein复合包埋CAP具有粒径小、载药量高、稳定性好的优势，并有望通过缓慢释放CAP改善其口服应用。

本文《负载辣椒素的巯基改性壳聚糖-玉米醇溶蛋白纳米颗粒制备与稳定性分析》来源于《食品科学》2023年44卷10期8-14页.作者：尹琬婷，李开鑫，马玲君，陈芳，廖小军，胡小松，季俊夫. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220807-085.

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