FSHW | 坛紫菜多糖通过重塑Hippo/YAP和mTOR通路之间的串扰减轻细胞增生

2023-08-15 09:55:47

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Introduction

多糖是紫菜中一种特殊的营养物质，通过调节关键的信号通路提供重要的生理活性。条斑紫菜和坛紫菜多糖已被证明通过NF-κB依赖的免疫细胞分化调节免疫稳态。然而，目前对紫菜多糖活性的详细分子机制的了解仍然有限。近年来，许多研究发现Hippo和mTOR信号通路在调控细胞增殖中发挥着极其重要的作用。Hippo通路抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，一旦受损可能导致多种类型的癌症。因此，Hippo和mTOR都是抗增生治疗的潜在靶点，开发针对这两条通路的新型调控方法并了解其详细的分子机制可以促进对不同类型癌症的控制。然而，坛紫菜多糖（PH）对结肠癌的控制作用及其分子机制鲜有报道。据推测PH可减弱细胞增生，从而抑制癌症，这是由关键的细胞信号通路介导的。

本研究旨在探讨PH抑制细胞增殖和治疗结肠癌的作用及其潜在的分子机制。从坛紫菜中分离多糖并应用于建立的结肠癌细胞模型。此外，揭示Hippo和mTOR信号通路的参与和串扰，加深对结肠癌分子机制的理解，为癌症治疗提供潜在的靶点和方法，并促进基于紫菜多糖的功能性食品的开发。

Results

PH的纯化和表征

采用常规表征方法测定PH化学含量，高效凝胶渗透色谱测定其峰分子量，气相色谱-质谱联用仪测定其单糖组成（表1）。如图1所示，PH在400～4000 cm^-1区域有特殊的吸收带。其中，3425 cm^-1处宽而强的峰归属于OH基团的伸缩振动，2926 cm^-1处出现较弱的C-H伸缩和弯曲振动峰。1654 cm^-1处的吸收峰是由水的吸收引起的，而1075 cm^-1左右的谱带归属于C-C和C-O振动，1255 cm^-1的峰表明存在硫酸盐。

图1 PH的FTIR光谱图

表1 PH的化学表征

PH抑制肠上皮细胞增生

用浓度为0.8 mg/mL的PH刺激培养的CMT93细胞24～72 h，MTT法检测CMT93的增殖情况（图2）。CMT93在整个过程中保持生长状态，PH在24 h后显著抑制细胞增殖。随着处理时间的延长，抑制作用更加显著。此外，PH对CMT93增殖的抑制作用呈剂量依赖性，尤其是0.8 mg/mL的PH对CMT93增殖的抑制作用约为0.2 mg/mL的两倍。

图2 PH抑制CMT93增殖

PH激活肠上皮细胞Hippo信号通路

通过qPCR检测了PH处理下Hippo通路相关基因的表达，验证Hippo通路是否参与了PH的抗增殖活性。PH抑制Hippo通路的核心转录共激活因子和调节因子YAP1的表达（图3A）。还抑制CTGF和Ankrd1的表达，Hippo通路抑制参与癌细胞增殖和侵袭的下游靶基因（图3B-C）。当Hippo通路被激活时，关键激酶LATS1保持高度磷酸化，转录共激活因子TAZ迅速降解，导致靶基因的抑制。蛋白质印记迹结果显示，PH处理后，LATS1的磷酸化水平升高，TAZ的蛋白水平降低。

图3 PH激活CMT93中的Hippo信号通路

图4 PH活性的蛋白质印迹分析

Hippo通路介导PH的抗增生活性

qPCR结果表明KD细胞系中YAP1的转录下降到50%以下（图5A），CTGF和Ankrd1的表达被抑制（图5B-C），证实Hippo通路的持续激活。在此基础上，进行PH处理，通过相关基因表达评估野生型（WT）和YAP1 KD细胞中Hippo通路的激活情况。PH抑制WT CMT93中YAP1、CTGF和Ankrd1的表达，但在YAP1 KD中下降不明显。同样，在YAP1 KD（图4，泳道5～6）中，PH引起的LATS1磷酸化增加和TAZ蛋白减少也被抑制。另一方面，与WTCMT93相比，YAP1 KD CMT93在PH刺激下的增殖没有明显变化（图6），表明YAP1在该过程中是必需的。

图5 YAP1 KD CMT93中Hippo信号通路的PH活性

图6 Hippo通路介导PH的抗增生活性

mTOR参与Hippo介导的PH的抗增生活性

PH处理后，mTOR靶基因Cyclin D1的表达（图7A）和通路关键激酶p70S6K的磷酸化均增加，并且可被mTOR抑制剂Rapa阻断，证明PH可以激活mTOR。如图7B-C所示，Rapa的应用显著促进CTGF和Ankrd1的表达，表明mTOR激活Hippo通路。然而，Rapa并没有阻断PH抑制CTGF和Ankrd1的作用。与此一致，Rapa直接增加TAZ蛋白水平，抑制LATS1磷酸化，但不阻断PH对这些蛋白（图4，泳道3～4）的影响。另一方面，敲低YAP1并没有显著改变稳态下mTOR活性，但阻断了PH对mTOR活性（图4，泳道5～6）的激活作用。这些结果表明Hippo和mTOR之间的串扰随着PH的处理发生了转换。

为了进一步验证mTOR在PH抗增殖活性中的作用，用Rapa阻断mTOR活性检测PH处理后CMT93细胞增殖情况。如图8所示，虽然PH显著抑制CMT93增殖，但Rapa的应用阻断了该作用，表明mTOR在PH的体外抗增殖活性中不可或缺。

图7 MTOR涉及PH活性

图8 MTOR通路介导PH的抗增生活性

Discussion

本研究评估PH抑制肠上皮细胞增生的活性，并探讨其潜在机制。发现Hippo和mTOR肿瘤发生发展的关键信号通路与PH活动相关。首先发现PH显著抑制CMT93增殖，提示PH在体外细胞模型中具有较强的抗增殖活性。PH在不同细胞类型上表现出相反的活性，可能是由于在免疫细胞中，NF-κB是调节细胞增殖的主要通路，而在结肠癌细胞中，Hippo和mTOR可能更为重要。

首次应用qPCR和蛋白质印迹检测PH对Hippo通路的影响。当Hippo通路激活时，上游激酶磷酸化LATS1/2，进一步磷酸化YAP1和TAZ，使其滞留在细胞质中，在蛋白酶体中迅速降解。在PH刺激后，观察到TAZ蛋白减少和LATS1磷酸化，表明Hippo通路被PH激活。下游靶基因CTGF和Ankrd1的表达也降低。因此Hippo的促进作用可能与PH的抗增生活性有关。

在YAP1KDCMT93细胞系中，PH对Hippo通路的影响均受损，PH的抗肿瘤活性被阻断。这些功能缺失的结果都表明YAP1是PH功能所必需的，Hippo/YAP信号通路介导PH的抗增生活性。基于此提出Hippo/YAP可能是PH以及食品中其他功能性成分治疗结肠癌的一个有前景的靶点。

在本研究中发现Rapa显著抑制Hippo通路，证明mTOR激活Hippo通路。尽管背景Hippo激活降低，但Rapa并没有削弱PH对Hippo的相对激活，表明mTOR并不参与PH诱导的Hippo激活。相反，PH的应用激活了mTOR通路，YAP1的敲低并没有直接调控mTOR，而是阻断了PH对mTOR的激活。此外，Rapa对mTOR的抑制阻断了PH对CMT93的抗增殖活性，表明mTOR对于PH的抗增殖功能是不可或缺的。总的来说，结果证明mTOR和Hippo可以相互激活，而mTOR在稳态时处于上游，Hippo在PH处理时处于上游。然而正常的促生长通路mTOR如何促进PH的抗生长活性，以及在PH处理下Hippo和mTOR之间的关系如何转换，需要更多的研究。

Conclusion

综上所述，本研究揭示了PH抗增生活性的详细分子机制（图9）。一方面，PH降低YAP1的表达，从而激活Hippo通路。由于Hippo和mTOR之间的串扰，mTOR被激活。Hippo和mTOR的激活均导致肠上皮细胞增生的抑制，从而介导PH的抗癌活性。另一方面，虽然mTOR可以激活Hippo，但该过程并不参与PH活动。阐明了PH对肠上皮细胞的生物学活性及其作用机制，为Hippo/mTOR通路与上皮细胞增殖的调控提供了理论依据，为进一步开展相关研究提供了思路。同时揭示Hippo/mTOR通路是结肠癌治疗的潜在靶点，为坛紫菜及其相关功能食品的利用提供新的途径，对功能食品和新药的开发具有重要的实用价值。

图9 PH抗增生活性的分子机制

Porphyra haitanensis polysaccharide (PH) attenuates cell hyperplasia via remodeling the cross-talk between Hippo/YAP and mTOR pathways

Chong Wang^a, Wanglei Lin^a, Zhihua Sun^a, Yiming Sun^b, Yanbo Wang^a, Linglin Fu^a,*

^a Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China

^b The Affiliated High School to Hangzhou Normal University, Hangzhou 310030, China

*Corresponding author.

Abstract

Porphyra polysaccharide is a special kind of nutrient showing multiple physiological functions including regulating cell proliferation, but the detailed mechanisms are not fully revealed, impairing its further development and applications. This work was to purify and characterize the Porphyra haitanensis polysaccharide (PH), investigate its physiological function, and demonstrate the underlying mechanisms. The purified PH was first characterized by Fourier-transform infrared spectroscopy. Then an intestinal epithelial cell model was established, in which PH significantly suppressed cell hyperplasia. Specifically, PH activated the Hippo/YAP pathway, which subsequently activated mTOR pathway, however mTOR activated Hippo in the absence of PH. Moreover, both the inhibition of Hippo by YAP1 knock-down and the suppression of mTOR by rapamycin impaired PH function. These results indicated that PH attenuated hyperplasia activity by remodeling the cross-talk between Hippo/YAP and mTOR pathways, which revealed potential targets and approaches for treating hyperplasia-related diseases and provided novel ways to utilize P. haitanensis as well as other related functional foods.

Reference:

WANG C, LIN W L, SUN Z H, et al. Porphyra haitanensis polysaccharide (PH) attenuates cell hyperplasia via remodeling the cross-talk between Hippo/YAP and mTOR pathways[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 424-430. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.044.

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