FSHW | 基于抗污聚多巴胺的荧光适配体传感器检测精氨酸激酶

2023-08-30 21:01:02

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Introduction

近年来，食物过敏已成为一个全球性的健康问题。贝类作为最常见的致敏性食品之一，有时会比其他食物致敏原引起更严重的症状。精氨酸激酶（AK）是贝类中主要致敏原之一。因其较高的热稳定性，AK的致敏性很难通过食品加工或烹饪过程消除。因此，亟需一种简单、有效的检测方法实现复杂水产品中AK的追踪与标记，以帮助过敏人群避免摄入食物致敏原。

传统的食物致敏原检测方法多存在检测时间长、操作繁琐复杂、仪器成本高等局限性。近年来，基于荧光共振能量转移（FRET）系统的生物传感器因其简单、灵敏度高和经济效益高的特点，被认为是最有潜力实现食物致敏原检测的方法之一。在靶标的作用下，受激供体和能量受体之间的距离会发生改变，从而产生荧光信号的变化，以此实现靶标的定量分析。聚多巴胺（PDA），一种受贻贝启发的含儿茶酚聚合物，具有亲水性、易于制备以及表面官能团可进一步改性等优点可以用于构建基于FRET的生物传感器。

复杂的食品基质干扰是食品致敏原测定的主要障碍之一。含有不同成分的食品基质可能会与探针发生非特异性相互作用，从而影响检测灵敏度。对于此，常常在传感器表面修饰聚乙二醇（PEG）等抗污材料，以抵抗复杂样品中非靶标成分的干扰。然而，PEG是否可用于抑制由复杂食品基质而非单一目标致敏原引起的非特异性相互作用仍不得而知。

Graphical abstract

本文利用PDA和荧光素酰胺标记的适配体（FAM-APT）之间的FRET效应，构建了一种AK荧光生物传感器。首次利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选AK特异性适配体，并采用荧光素酰胺（FAM）进行标记。通过PEG和互补序列（CS）修饰PDA，与荧光染料标记的适配体进一步杂交，构建基于PDA的生物传感器。由于FRET效应，适配体的荧光会被PDA淬灭（图1a），而AK的存在使适配体与CS分离并重新产生荧光信号（图1b）。通过研究PEG修饰的PDA对非特异性蛋白质的抗污能力及其对检测性能的影响，探索使用抗污涂层抑制非靶标食品成分干扰的可行性。此外，对该适配体传感器的检测性能进行了评价，并对9种虾和5种虾加工产品中的AK进行了定量分析，以验证该生物传感器在实际应用中的可行性。

图1 基于PDA的适配体传感器检测AK的示意图

Results and Discussion

AK特异性适配体的筛选

采用基于磁珠（MB）的SELEX快速筛选AK特异性适配体，筛选得到8条代表性序列作为候选序列并进行高通量测序。这8条序列对AK均表现出较高的亲和力（图2a），其中，候选序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的K_d值较低，进一步进行特异性测试以选择最佳序列。如图2b所示，序列Ⅱ对AK具有很高的特异性，同时具有更高的亲和力。因此，选择序列Ⅱ（5'-GGCGAACAGCAGCGCGATTCGGGTTGCGGATAGTGACATA-3'）作为构建PDA传感器的最佳适配体。考虑到虾、牡蛎和鱿鱼中AK的高度保守序列，该适配体可作为追踪食物中贝类AK的识别元件。

图2 （a）8条候选序列I-VIII的饱和曲线及K_d值，（b）序列Ⅰ，Ⅱ，Ⅶ对AK的特异性

基于PDA适配体传感器的制备

如图3所示，PDA-PEG/CS-APT颗粒呈圆形，在300～900 nm范围内表现出较宽的紫外吸收峰。PDA的粒径为（141.8±1.5） nm，经HS-PEG2000和HS-CS共修饰后粒径增加至（190.1±3.7） nm，与FAM-APT互补结合后进一步增加至（220.2±5.2） nm。这表明PEG、CS和FAM-APT与PDA的成功结合。此外，在50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）中，PDA-PEG/CS-APT没有发生团聚或粒径增加的现象，而PDA-CS-APT的粒径随着时间的推移而急剧增加，并在其瓶底观察到沉积物。这可能是因为PEG的亲水性，使得PDA-PEG/CS-APT比PDA-CS-APT具有更好的稳定性。

图3 PDA-PEG/CS-APT的（a）TEM图、（b）UV-Vis光谱、（c）粒径分布图以及（d）稳定性

基于PDA适配体传感器的抗污性能

比较基于PDA的适配体传感器与蛋白溶液孵育前后的粒径变化，结果显示，PDA-CS/PEG在BSA溶液（图4a）或虾全蛋白提取溶液（图4b）中孵育4 min后，其粒径没有显著增加。而PDA-CS与BSA和虾全蛋白提取溶液孵育后，粒径从（190.1±3.7） nm分别增加到（255.4±3.7）和（342.2±0.8） nm。这表明PDA-CS/PEG比PDA-CS具有更好的抵抗蛋白质非特异性吸附能力。采用BCA方法进一步测定PDA表面非特异性蛋白质的吸附量，结果如图4c和4d所示，PDA-CS/PEG的蛋白质吸附量显著小于PDA-CS，进一步证实了PDA-CS/PEG的良好抗污性能。

图4 （1）PDA-CS/PEG和（2）PDA-CS在（a）BSA溶液和（b）南美白对虾全蛋白溶液中的粒径变化图，在（c）BSA溶液和（d）南美白对虾全蛋白溶液中非特异性蛋白的吸附量

适配体传感器对AK的检测性能

采用PDA-PEG/CS-APT检测AK时，AK浓度与荧光强度之间存在线性关系，标准曲线方程为y＝1897x＋82.66，R²为0.9905（图5a）。进一步计算检出限为0.298 μg/mL（S/N=3），定量限为0.995 μg/mL（S/N=10）。通过TM、BSA、OVA、胃蛋白酶和胰蛋白酶探究PDA适配体传感器对AK检测的特异性，结果如图5b所示，观察到非特异性蛋白荧光信号均显著低于AK的荧光信号，表明该方法具有优异的特异性。

图5 （a）基于PDA-CS/PEG的AK检测标准曲线和（b）检测特异性

虾及其加工产品中AK的检测

精氨酸激酶是一类在不同贝类中相对保守的蛋白质，这使得基于PDA的适配体传感器可以用于不同种虾或其加工产品中AK的检测。中国对虾、中华管鞭虾、鹰爪虾、日本沼虾、基围虾、阿根廷红虾、斑节对虾、口虾蛄、南美白对虾中AK的含量分别为（1.16±0.37）、（1.13±0.19)、（0.98±0.11）、（0.37±0.05）、（1.92±0.12）、（0.98±0.11）、（0.55±0.03）、（1.89±0.18）和（1.63±0.20） mg/g。从当地市场购买的不同虾产品，虾饺、虾味饺、虾肉丸、虾泥和干虾米中的AK含量分别为（0.70±0.02）、（0.17±0.04）、（2.56±0.25）、（0.89±0.07）和（0.45±0.05） mg/g。同时，通过ELISA方法进行对比验证。以上结果表明，基于PDA的适配体传感器成本较低，在对虾的AK检测中具有良好的应用前景，并且可以进一步应用于不同品种虾中AK的检测或以AK为识别标记鉴定虾产品的掺假问题。

Conclusion

本文构建了一种基于PDA的适配体传感器，该传感器依赖于PDA与FAM-APT之间的FRET效应，表面修饰有PEG可以提高其对非特异性蛋白吸附的抵抗能力。该适配体传感器对AK的线性检测范围为0.995～2.5 μg/mL（R²＝0.9905），检出限为0.298 μg/mL。本方法具有良好的特异性和准确性。此外，通过对9种虾样品和5种虾加工产品中的AK进行定量分析，证明该传感器对实际样品中食物致敏原的检测具有较好的鉴定能力。

An antifouling polydopamine-based fluorescent aptasensor for determination of arginine kinase

Yanbo Wang, Huan Li, Jinru Zhou, Fangting Wang, Yifan Qian, Linglin Fu*

Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China

*Corresponding author.

Abstract

Simple yet efficient detection methods for food allergens are in urgent need to help people avoid the risks imposed by allergenic food. In this work, a polydopamine (PDA)-based fluorescent aptasensor was developed to detect arginine kinase (AK), one of the major allergens in shellfish. The aptamer towards AK was firstly selected via systematic evolution of ligands by exponential enrichment method and labeled with fluorescein amidite (FAM) to build a fluorescence resonance energy transfer (FRET) system with PDA particles. Polyethylene glycol (PEG) was employed to construct an antifouling surface for the aptasensor to eliminate food matrix interferences. With the presence of AK, the PDA-based aptasensor exhibited elevated fluorescent signals as the FAM-labeled aptamer bound to AK and detached from the PDA particles. The aptasensor showed great stability and resistance to nonspecific interference of background proteins and had a limit of detection (LOD) of 0.298 μg/mL. The proposed aptasensor was further proved to be feasible for quantitative analysis of AK in nine species of shrimps and five commercial processed products, which indicated its high potential in tracing the presence of AK in complex aquatic products.

Reference:

WANG Y B, LI H, ZHOU J R, et al. An antifouling polydopamine-based fluorescent aptasensor for determination of arginine kinase[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 737-744. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.007.

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