河北省食品安全重点实验室孙磊高级工程师等：超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的13 种利尿

2023-11-17 23:06:03

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利尿剂是作用于肾脏，增加电解质和水排出的能够产生利尿作用的一类药物，在临床上广泛应用于利尿消肿、降压和脑水肿等治疗。利尿剂因为具有很强的排尿能力在需要快速减肥才能达到某一体质量类别的运动中经常被滥用。利尿剂还可以作为掩蔽剂增加尿量，从而稀释一些违禁兴奋剂的浓度，使这些违禁兴奋剂的检测变得更加困难。另外，利尿剂还被应用到动物饲养当中，用于治疗奶牛乳房炎，或者是改善禽蛋蛋白比例等。这会使利尿剂在动物体内存在残留。运动员误食这些食品后不仅会对身体健康产生负面影响，也会造成尿检阳性事件。所以开发出一种灵敏、简捷的检验食品中违禁利尿剂的分析技术手段刻不容缓。

目前，利尿剂的检测主要针对人及动物的尿样、保健品和饲料等样品，目前有多种检测方法。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）可以不用衍生化的处理，而且灵敏度高、准确度好、应用广泛。因此，河北省食品安全重点实验室的任晓伟、孙磊*、马俊美*等人开发出了一种直通型SPE联合内标法检测13 种利尿剂的新型UPLC-MS/MS方法。该方法简单高效、精密度好、重复性好和特异性强，适用于动物源性食品中13 种利尿剂的批量、准确检测。

01 前处理条件的优化

甲醇和乙腈是动物源性食品中常用的有机提取试剂，考察甲醇和乙腈对13 种利尿剂的提取效果。结果显示：用乙腈时响应值普遍更高，13 种利尿剂的回收率更好（图1）。

据报道，乙腈具有蛋白质沉淀效果好、相容性好、脂溶性低等优点，被广泛应用于食品中有毒有害物质的提取。但是，当使用甲醇或乙腈提取时，肌肉组织容易聚集导致提取溶剂不能充足的渗入样品，而使用有机试剂的水溶液就能有效避免肌肉组织的这种聚集。因此，本研究还对比乙腈、90%乙腈溶液和80%乙腈溶液对肌肉组织中利尿剂的提取效果。结果显示：对于猪、牛、羊、禽类使用90%乙腈溶液提取效果更好（图2）。对于猪、牛、羊、禽类食品，最佳提取溶剂为90%乙腈溶液；对于鸡蛋和牛奶类食品，最佳提取溶剂是乙腈。另外，动物源性食品中基质复杂。进样前进行净化处理是很有必要的。本研究采用PRiME HLB通过式固相萃取柱净化，省去了常规SPE的分析操作步骤（活化、淋洗和调整pH值）。该操作能有效分离出动物源性食品中富含的磷脂类化合物和脂肪等物质，提高分析灵敏度。由图3可见，经PRiME HLB通过式固相萃取柱净化后的鸡肉样品，以基质成分的强度估算，基质成分明显减少。

02 基质效应评价

基质效应会抑制或增强被分析物的信号，导致定量结果的不准确和仪器寿命缩短。在本研究中，采用基质和溶剂所绘标准曲线的斜率比值评价基质效应对实验结果的影响程度。当斜率比值大于1.2或小于0.8时，基质效应就会影响分析结果。为有效消除基质效应对分析结果造成的影响，本实验选用鸡肉作为基质对比无内标和有内标时13 种利尿剂的基质效应。如表4所示，在不使用内标时仅有7 种利尿剂无显著的基质效应。而使用内标后13 种利尿剂的斜率比值均在0.8～1.2之间，基质效应对分析结果的影响可以忽略。这一结果证实了内标法可以消除基质效应造成的定量结果偏差，提高检测方法的稳定性和精准性。

03 色谱条件的优化

本研究测验多个液相色谱参数对13 种利尿剂及其内标物分离效果的影响。本研究的流动相采用乙腈和乙酸铵溶液，同时使用梯度洗脱对目标化合物进行有效分离。图4显示了13 种利尿剂优化后的SRM谱图。

04 质谱条件的优化

将13 种利尿剂及其内标物的标准溶液注入质谱，从结构上分析，有的化合物容易带正电荷，即正离子电离信号响应强；有的化合物容易带负电荷，即负离子电离信号响应强。因此，母离子扫描使用ESI＋/ESI-模式。其中在正模式下，质子化的分子[M＋H]＋作为基峰；在负模式下，去质子化的分子[M-H]-作为基峰。在这种条件下，对相应的母离子峰实施后续的子离子扫描，得到它们各自的子离子，并挑选2 对响应值高的子离子进行二级质谱参数优化。优化后的相关参数见表2、3。

05 线性关系考察和方法定量限

使用内标法对供试品溶液中的利尿剂进行数据分析，其中内标法采用以各个利尿剂质量浓度为X轴，以各个利尿剂对其内标物的峰面积的比值为Y轴。测定数据见表5。

06 回收率和精密度实验结果

实验选取猪肉、鸡肉、鸡蛋和牛奶4 种空白基质进行精密度和准确度的实验，在每种空白基质中分别加入相应量的13 种利尿剂混合标准工作液以及混合内标工作液制成一定浓度的质控样本：高、中和低浓度水平，每个水平独立检测6 次。如表6所示，在猪肉中，加标回收率为68.8%～115.9%以内，相对标准偏差（RSD）为0.47%～9.5%。在鸡肉中，加标回收率在73.0%～116.6%以内，RSD为0.51%～9.3%。在鸡蛋中加标回收率为68.3%～117.9%，RSD 为0.59%～8.7%。在牛奶中加标回收率为69.9%～118.0%，RSD为0.72%～6.6%。

07 结论

本实验成功地开发了一种通过式SPE-UPLC-MS/MS同时检测肉、蛋、奶食品中13 种利尿剂的新型方法。采用乙腈或90%乙腈溶液为提取试剂，有效提取样品中13 种利尿剂，采用PRiME HLB柱净化后，有效去除了样品中的杂质，同时使用同位素内标法在一定程度上排除了基质效应对结果的干扰。该方法简单、高效，实现了对动物源性食品中13 种利尿剂的精确定量分析。本方法不仅可以作为一种执法监督和检查手段，为动物源性食品中的利尿剂的检测提供依据，也可以作为其他方法的辅助手段，为其他研究人员提供技术支持。

本文《超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的13 种利尿剂》来源于《食品科学》2023年44卷14期360-367页，作者：任晓伟，范力欣，何亮娜，孙磊，马俊美。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20220715-177。

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