北京工商大学贾英民教授等：爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用机制

2023-11-21 22:41:21

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苹果、梨、桃等日常食用的水果营养丰富，但是水果在采收、包装、运输和贮藏过程中容易出现机械损伤，加速病原真菌侵染果实，导致水果腐烂变质。由扩展青霉引发的青霉病不但能导致果实腐烂，还会产生展青霉素、棒曲霉素、桔青霉素等致病毒素从而危害人类健康。生物防治作为一种现代新兴技术，受到社会各界的广泛欢迎。类芽孢杆菌是一种能产生抗性芽孢的好氧或兼性厌氧的杆状细菌，可以用于植物和动物疾病的生物防治。爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis）具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和病原真菌具有较好的抑制作用。

河北科技大学食品与生物学院的王志新、刘丹丹和北京工商大学食品与健康学院的贾英民等前期从爱媛类芽孢杆菌HD中分离纯化出具有广谱抑菌性的抗菌肽，其对真菌抑制效果较好，且抑制作用高效、稳定。爱媛类芽孢杆菌经过发酵后收集其发酵上清液，采用大孔树脂吸附-解吸附法获得抗菌肽的粗提液，进一步利用半制备高效液相色谱法进行抗菌肽的纯化，获得纯度不低于98%的抗菌肽，命名为爱媛类芽孢杆菌抗菌肽ehimensin。本研究以采后水果常见的腐败菌——扩展青霉作为指示菌，考察爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对其抑菌活性，之后分别从孢子萌发、形态结构、细胞壁、细胞膜、活性氧累积等方面探讨抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制机理，以期为水果采后防腐提供理论依据，并为新型天然果蔬保鲜剂的开发提供参考。

01 结果与分析

1.1 抗菌肽对扩展青霉孢子的抑菌活性

采用微量二倍稀释法测定抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用。其MIC为3.5 AU/mL。通过时间-杀菌曲线进一步探究抗菌肽对扩展青霉的抑菌活性。由图1可知，空白对照组（0 MIC）的孢子生长正常，菌体量稳定在初始浓度；处理组随着抗菌肽质量浓度的增加，扩展青霉孢子数量减少。2 MIC处理组在作用1 h后对孢子开始表现出抑制作用，作用12 h后可以完全抑制孢子的生长，将孢子全部杀灭。

1.2 抗菌肽对扩展青霉孢子萌发的影响

如图2、3所示，空白对照组（0 MIC）孢子的萌发率为100%，孢子全部萌发，且长出了较长的芽管。0.5 MIC抗菌肽对孢子产生了一定程度的抑制，萌发率为71.7%，与空白对照组相比降低28.3%（P＜0.05），且芽管长度变短。当抗菌肽质量浓度为1 MIC时，孢子萌发率发生了较大的变化，下降到15.43%，与空白对照组相比降低84.57%，且芽管生长长度较短；2 MIC处理组孢子萌发率为0%。

本研究发现被抑制萌发的扩展青霉孢子会发生皱缩。孢子萌发过程中会先吸水膨胀然后长出芽管，本研究中抗菌肽对孢子萌发的抑制效果较强，2 MIC处理组能够完全抑制孢子萌发，因此孢子未出现肿胀现象；同时结合后续扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察结果可知，抗菌肽会使孢子出现凹陷、内容物泄漏等现象。

1.3 抗菌肽对扩展青霉孢子超微结构的影响

扫描电子显微镜观察结果如图4所示。空白对照组（0 MIC）孢子表面较为饱满、完整，且轮廓清晰，呈椭圆形。随着抗菌肽质量浓度的增加，孢子凹陷程度逐渐加剧，高质量浓度处理组甚至出现破裂现象，内容物的泄漏量也在逐渐增多。

透射电子显微镜观察结果如图5所示。空白对照组（0 MIC）孢子的细胞壁和细胞膜较完整且表面轮廓清晰，细胞质分布均匀。与空白对照组相比，1 MIC抗菌肽处理后的孢子表面形态发生了变化，细胞质稀薄且内容物出现泄漏。2 MIC抗菌肽处理的扩展青霉孢子细胞变形严重，质壁分离现象明显，细胞质密度严重降低。综上，对孢子超微结构的观察结果表明抗菌肽会使扩展青霉孢子发生形态和结构变化。

1.4 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞壁完整性的影响

碱性磷酸酶AKP位于细胞壁和细胞膜之间，当菌体细胞壁完整性被破坏，AKP会从菌体中释放到体外，故可通过测定AKP的活力来判断抗菌肽对细胞壁通透性的影响。由图6可知，与空白对照组（0 MIC）比较，处理组的AKP活力高于空白对照组，可见，抗菌肽对扩展青霉孢子细胞壁具有一定的破坏作用。

1.5 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜跨膜电势的影响

DiSC3(5)是一种亲脂性荧光探针，进入细胞内质膜中会发生荧光猝灭，结构完好的细胞中存在一定的跨膜电势，当细胞膜的通透性发生变化或离子通道受到影响时，膜电势会消失，荧光染料会从细胞膜中释放出来，导致荧光信号增强。如图7所示，随着抗菌肽质量浓度的增加，荧光强度逐渐增加。处理180 s时，空白对照组（0 MIC）荧光强度为70.91，0.5、1、2 MIC处理组抗菌肽的荧光强度分别增加至119.4、138.2、163.3。由此说明该抗菌肽会造成扩展青霉孢子细胞膜跨膜电势降低，引起细胞膜去极化。

1.6 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜渗透性的影响

当扩展青霉细胞发生膜去极化时，K^＋的连续流失会导致细胞死亡。通过不具备膜渗透性的PBFI探针考察不同质量浓度抗菌肽对扩展青霉钾离子泄漏的影响，结果如图8所示。抗菌肽与扩展青霉孢子作用30 min后，处理组荧光强度显著增加（P＜0.05），K^＋泄漏量与抗菌肽的质量浓度呈正相关。由此推测，抗菌肽能够使扩展青霉孢子细胞膜的渗透性发生改变，导致K^＋泄漏，膜功能受到破坏，加速细胞死亡。

1.7 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜流动性的影响

DPH是一种用于研究膜脂流动性的荧光探针，可以与扩展青霉孢子的疏水区结合，而不会干扰脂质双层结构，DPH的荧光强度可以用来衡量细胞膜磷脂双分子层损伤的程度。如图9所示，经过0、0.5、1、2 MIC抗菌肽处理后，DPH的荧光强度分别为1 547.67、1 110.00、612.07和388.80；随着抗菌肽质量浓度的增加，DPH荧光强度显著降低（P＜0.05），说明抗菌肽破坏了扩展青霉孢子细胞膜的流动性。

1.8 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜完整性的影响

SYTOX-Green荧光染料不具有膜渗透性，只有在膜完整性受损或者形成孔洞时，其可以与细胞核结合，在一定条件下发出绿色荧光。结合图10和图11可见，抗菌肽作用后的孢子荧光强度显著增加，说明该抗菌肽会使扩展青霉孢子细胞膜的完整性受损。空白对照组（0 MIC）荧光强度在130左右，在荧光显微镜下看不到绿色。0.5、1、2 MIC处理组孢子荧光强度分别为373、437和527。随着抗菌肽质量浓度的增加，呈绿色荧光的孢子比例增加，荧光强度逐渐增大，说明孢子的膜受损率增加。

如图12所示，空白对照组（0 MIC）的PI沾染率为3.3%，0.5、1、2 MIC处理组PI沾染率分别为7.7%，26.7%和73.3%。随着抗菌肽质量浓度的增加，PI的沾染率增加，说明抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜具有破坏作用，且与抗菌肽质量浓度呈正相关性。该结果与SYTOX-Green荧光染色结果趋势一致，进一步验证了抗菌肽会破坏扩展青霉孢子的细胞完整性。

1.9 抗菌肽对扩展青霉孢子胞内活性氧的作用

如图13所示，随着抗菌肽质量浓度的升高，DCFH-DA荧光强度逐渐增大。空白对照组（0 MIC）与0.5 MIC抗菌肽处理组DCFH-DA荧光强度差异不显著，但与1 MIC和2 MIC处理组之间有显著性差异（P＜0.05）。说明抗菌肽影响了扩展青霉孢子中活性氧的积累，从而抑制了扩展青霉孢子正常的生长繁殖。

02 讨论

本研究以新型的抑菌物质抗菌肽作为抑菌剂，探究其对引起水果腐败的常见病原菌——扩展青霉的抑菌作用。结果表明，经0.5、1、2 MIC抗菌肽处理后，扩展青霉孢子的萌发率分别为71.7%、15.43%和0%。抗菌肽对指示菌孢子萌发具有较好的抑制作用。孢子有坚实的孢子壁和皮层，孢子的破坏程度能反映抗菌肽对孢子的抑制效果。通过透射电子显微镜与扫描电子显微镜观察发现，随着抗菌肽质量浓度的增加，孢子破损严重。由此表明抗菌肽对扩展青霉具有良好的抑制效果。不同质量浓度的抗菌肽在较长时间内对扩展青霉孢子能持续发挥抑菌作用，且抑制效果与抗菌肽浓度呈正相关。在此基础上，本研究进一步开展了抗菌肽对扩展青霉孢子抑菌机理的研究。

本研究中，抗菌肽可使扩展青霉孢子的AKP从菌体中释放到体外，由此可知其对扩展青霉孢子细胞壁完整性有一定破坏作用。抗菌肽可影响扩展青霉孢子的细胞膜流动性，并且使其电势消散，引起细胞膜去极化。细胞膜去极化将通过质膜电压门控钙离子通道和其他未知转运体诱导钙离子摄取，从而诱导细胞凋亡和细胞程序性死亡。本研究中的抗菌肽在导致细胞膜去极化的同时，还改变了细胞膜的渗透性，使K＋发生泄漏。K＋渗透和细胞内的渗透压失衡反过来会导致细胞内细胞器的破坏和细胞收缩，进而导致细胞死亡。

通过对扩展青霉孢子进行SYTOX-Green和PI染色发现，随着抗菌肽质量浓度的增加，SYTOX-Green荧光强度逐渐升高，PI沾染率也在不断增加。可见抗菌肽会破坏扩展青霉孢子细胞膜的完整性。观察扩展青霉孢子的超微结构也进一步验证了抗菌肽会破坏细胞膜的完整性，使细胞的形态发生改变、内容物泄漏。微生物细胞膜的完整性会直接影响细胞的生长繁殖，当细胞膜被破坏时，就会扰乱能量与信息传递，从而使微生物生长受到抑制甚至死亡。

活性氧是真菌细胞凋亡的一个主要介导因素。正常情况下，细胞内部和线粒体基质中有完善的抗氧化防御体系，能够保持活性氧在一个比较低的生理浓度。在病理情况下，活性氧产生过多，会氧化细胞内的生物大分子，损伤细胞和线粒体，诱导细胞凋亡。DCFH-DA是一种可以检测胞内活性氧积累情况的探针，本身没有荧光，其进入细胞后，可以被细胞膜内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不会通过细胞膜，容易聚集在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。经抗菌肽处理的扩展青霉孢子中出现了活性氧的累积，从而抑制扩展青霉孢子正常的生长繁殖。

03 结论

爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子具有良好的抑菌效果，可以抑制孢子萌发，对细胞壁完整性有一定破坏作用。爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制靶点主要为细胞膜。抗菌肽破坏了细胞膜的完整性，使细胞的形态发生改变、内容物泄漏；消散了扩展青霉孢子的跨膜电势；增加了细胞膜的渗透性，造成K^＋泄漏；增加了细胞膜的流动性。抗菌肽作用于扩展青霉孢子的另一个靶点是活性氧，抗菌肽使扩展青霉孢子中活性氧积累，影响其正常的生长代谢，从而抑制扩展青霉孢子正常的生长繁殖。本研究可为水果采后保鲜贮藏方面的应用提供一定的参考，并为水果病害的安全、高效防治提供理论依据。

第一作者简介

王志新，女，博士，毕业于江南大学发酵工程专业，现为河北科技大学食品与生物学院教授，硕士生导师，河北省“三三三人才工程”三层次人选。主要从事食源性致病菌的抑菌研究，主要开展食源性致病菌相关生物源抑菌剂的开发、应用及抑菌机制研究。主持完成国家重点研发计划子课题1 项、河北省重点研发计划1项和河北省自然科学基金1 项，现主持河北省自然科学基金1 项和河北省重点研发计划1 项。发表学术论文30余篇，授权国家发明专利3 项，研制国家标准样品1 个，制订国家标准2 项。

本文《爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用机制》来源于《食品科学》2023年44卷第15期19-27页，作者：王志新, 刘丹丹, 贾紫伟, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220628-316。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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