江苏省农业科学院张辉研究员等：单核细胞增生李斯特氏菌内化素InlJ对噬菌体敏感性及生物被膜形成的影响

2023-12-13 23:53:35

301

字体 A+ A A-

李斯特菌属（Listeria spp.）是一类能够引起动物和人李斯特菌病的革兰氏阳性细菌（G^＋），其中单核细胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes，Lm）是最重要的食源性人兽共患病原菌。已有研究表明，约80%细菌感染与生物被膜形成有关，60%食源性食物中毒暴发事件均是由食源性致病菌生物被膜引起。内化素InlA是最早鉴定出与宿主细胞特异性受体结合介导Lm进入非吞噬细胞的毒力因子。目前仅有研究表明inlJ基因缺失可导致其毒力降低，因而明确InlJ功能将有助于揭示拥有LPXTG及LRR结构域蛋白的新功能。InlJ是Lm细胞壁表面蛋白家庭成员，能够共价结合到细胞壁肽聚糖上，从而可能参与噬菌体与宿主的相互作用。

为了进一步解析inlJ基因功能，陕西科技大学食品与生物工程学院的刘半红、胡梁斌和江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所的张辉*利用同源重组方法构建inlj基因缺失菌株，并对缺失株的生物学特性、噬菌体敏感性以及生物被膜形成进行研究，以期更有效地揭示inlJ基因在噬菌体与Lm相互作用中的调节功能。

1 重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ的鉴定

对穿梭载体pKSV7和基因片段ΔinlJ酶切，T₄ DNA连接酶连接，转化至DH5α，挑选阳性克隆，测序结果表明，ΔinlJ缺失序列分别由上游222 bp和下游239 bp组成，全长共461 bp。电泳结果和预期大小相符，测序结果比对一致，表明重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ构建成功（图1）。

2 Lm NJ05-ΔinlJ构建、筛选与鉴定

如图2所示，pKSV7-ΔinlJ质粒和inlJ基因缺失株扩增产物均为332 bp，未扩增出inlJ序列；而Lm NJ05野生株扩增产物为2888 bp的inlJ基因序列（图2），表明inlJ基因完全缺失，成功构建稳定的inlJ基因缺失株，命名为Lm NJ05-ΔinlJ。

3 Lm NJ05-ΔinlJ生长曲线测定

将Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ在37 ℃条件下培养10 h，通过酶标仪检测其OD_600nm值，根据结果绘制生长曲线见图3，显示缺失株Lm NJ05-ΔinlJ与野生株Lm NJ05在0～3 h时间段内均处于适应期，3～7 h时间段内处于对数期，生长趋势无显著差异，由此可见，inlJ基因的缺失对其生长特性无显著影响。

4 黏附性与侵袭性

通过RAW264.7细胞分析缺失株Lm NJ05-ΔinlJ对细胞黏附和侵袭活性的变化，由图4可知，Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ对RAW264.7细胞的黏附率分别为33.5%和20.05%（图4），Lm NJ05-ΔinlJ的黏附能力显著降低（P＜0.05）。对RAW264.7细胞的侵袭性结果表明，Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ对RAW264.7细胞的侵袭力分别为8.25%和4.42%（图5），缺失株侵袭力显著下降（P＜0.01）。综上所述，inlJ基因缺失对细胞的黏附和侵袭性均减弱。

5 Lm NJ05-ΔinlJ对噬菌体vB-LmoM-NJ05敏感性

通过EOP分析Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ对噬菌体的敏感性。结果表明，Lm NJ05-ΔinlJ EOP较Lm NJ05高至2.72 倍（表3），表明inlJ基因缺失会影响噬菌体和宿主菌株之间的敏感性，成斑效果增强。此外，与野生株Lm NJ05相比，缺失株Lm NJ05-ΔinlJ形成的噬菌体斑更加清晰透明（图6），进一步表明缺失inlJ基因能够增强其与噬菌体的敏感性。

6 Lm NJ05-ΔinlJ对噬菌体vB-LmoM-NJ05裂解活性

由图7可知，噬菌体vB-LmoM-NJ05对Lm NJ05-ΔinlJ抑制效果更显著。在作用2 h内，噬菌体对Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ作用效果相似，但在2 h后至10 h，噬菌体对Lm NJ05-ΔinlJ的敏感性明显增强，与Lm NJ05相比呈显著差异。由此可见，inlJ基因缺失能够增强其对噬菌体vB-LmoM-NJ05裂解活性。

7 噬菌体对Lm生物被膜抑制及清除效果

由图8可知，inlJ基因缺失之后，Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜形成能力显著降低（P＜0.01），当噬菌体vB-LmoM-NJ05以10⁵ PFU/mL作用Lm，能够有效抑制生物被膜的形成，且对Lm NJ05-ΔinlJ抑制能力更强（P＜0.05），同样以10⁶～10⁸ PFU/mL噬菌体作用后，能够完全抑制生物被膜形成。利用噬菌体清除生物被膜的结果表明，当以10⁸ PFU/mL噬菌体作用时，能够完全清除Lm NJ05-ΔinlJ形成的生物被膜，与Lm NJ05呈显著差异（图9，P＜0.001）。由此可见，inlJ基因的缺失，使其生物被膜的形成能力减弱，从而使噬菌体对其清除力更为显著。

8 生物被膜形成相关基因的转录分析

flaA、degU、agrA、agrD和luxS等基因参与早期生物被膜形成，而yneA、recA和hpt等基因作用于生物被膜成熟阶段。RT-real-time PCR的结果表明，与Lm NJ05相比，Lm NJ05-ΔinlJ编码生物被膜相关基因degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA和hpt的转录水平均下降（图10）。当噬菌体vB-LmoM-NJ05作用缺失株后，生物被膜相关基因转录水平下降极为明显，均呈下调趋势。由此可见，inlJ基因缺失负调控生物被膜形成相关基因的表达，降低生物被膜的形成能力。此外，当噬菌体作用后，生物被膜形成相关基因转录下调极为显著，从而缺失株生物被膜形成能力减弱，噬菌体对其更具清除能力。

讨论

Lm表面蛋白是细菌代谢、群体感应、生物被膜形成和毒力基因表达调控的重要调节因子，与细菌致病性密切相关。由于表面蛋白的存在使Lm能够在低温环境中复制增殖，并且侵染多种真核细胞。迄今为止，在Lm基因组中发现了41 个编码LPXTG蛋白的基因，inlA是最早被发现的介导Lm入侵宿主细胞的LPXTG表面蛋白基因，其主要作用机制是与宿主细胞上的特异性受体结合，诱导非吞噬细胞将菌体内吞进入细胞内部寄生，许多研究表明inlA在穿透肠道屏障的过程中发挥重要作用。inlJ是编码LPXTG蛋白的基因之一，本研究中，Lm NJ05-ΔinlJ对RAW264.7细胞侵袭和黏附均显著降低，由此表明，inlJ参与了Lm的毒力作用机制。

在本研究中，重点分析了食源性Lm NJ05中inlJ基因作用特性，结果表明inlJ基因缺失使其对噬菌体vB-LmoM-NJ05的敏感性增强。缺失株Lm NJ05-ΔinlJ对噬菌体的EOP增加到2.72 倍，噬菌斑更清晰透明，且噬菌体对Lm NJ05-ΔinlJ抑制活性更强。由此可见inlJ基因参与Lm与噬菌体的相互作用。

本研究中inlJ基因的缺失降低了Lm生物被膜的形成，这可能是InlJ与InlK一样同属于Lm表面蛋白，与细菌胞外蛋白或组织表面的物质发生相互作用，有利于Lm黏附在物体表面促进生物被膜的形成。此外，本研究发现噬菌体vB-LmoM-NJ05也能够很好地抑制和清除Lm生物被膜，特别是对于Lm NJ05-ΔinlJ缺失株，抑制效果更为明显，这可能与InlJ表面蛋白的缺失导致生物被膜的形成能力降低，噬菌体vB-LmoM-NJ05对Lm NJ05-ΔinlJ敏感性增强相关。Lm生物被膜的形成与很多因素相关，例如鞭毛糖蛋白相关因子FlaA、DegU，群体感应系统相关因子Agr、LuxS和胞外基质相关因子yneA、Hpt等。本研究发现inlJ基因的缺失导致参与生物被膜形成的相关基因表达降低，并且在Lm NJ05-ΔinlJ与噬菌体vB-LmoMNJ05相互作用后，使这些基因几乎无应答。由此表明，inlJ基因缺失影响生物被膜基因表达，降低Lm生物被膜的形成能力，与噬菌体作用之后，生物被膜形成相关基因表达持续降低，以此抑制和清除生物被膜。综上所述，LPXTG蛋白会参与噬菌体与Lm间的识别及互作，目前暂未见相关报道，但其为LPXTG蛋白在噬菌体敏感性中的功能揭示将为噬菌体对抗菌和治疗中提供重要的理论支撑。

结论

通过同源重组技术成功构建了缺失株Lm NJ05-ΔinlJ，inlJ基因缺失对细胞的黏附和侵袭性下降，减弱了生物被膜形成能力，但对噬菌体的敏感性显著增强，进而使噬菌体对缺失株Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜的抑制和清除能力得到了显著提高，生物被膜形成相关基因的表达呈下调趋势。由此可见，作为LPXTG蛋白成员的InlJ参与噬菌体与Lm间的识别及相互作用，这为LPXTG蛋白新功能的揭示奠定了重要依据，为噬菌体的生物防治提供了新的理论依据。

本文《单核细胞增生李斯特氏菌内化素InlJ对噬菌体敏感性及生物被膜形成的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第16期198-204页，作者：刘半红，胡梁斌，陆睿，吴立婷，包红朵，周艳，王冉，张辉*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220922-219。

专题专栏