江西农业大学王纯荣教授等：基于表面增强拉曼光谱和偶氮偶联反应对组氨酸的灵敏检测

2023-12-14 00:06:44

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氨基酸是一种在自然界中普遍存在的具有羧基（—COOH）和氨基（—NH2）的有机酸，是组成蛋白质的基本单位。其中，组氨酸（His）作为一种半必需氨基酸，对于婴幼儿及动物的成长尤其重要，对His的快速检测具有重要意义。表面增强拉曼光谱（SERS）是一种可以提供分子振动的专属性指纹信息并进行多重识别的高灵敏度的振动光谱技术，可以实现快速、无损和原位检测。有研究表明，在强酸条件下，胺类物质（—NH2）可通过偶氮偶联反应被氧化为重氮盐，并与酚类、苯胺和一些杂环化合物在碱性或中性溶液中发生偶联，生成偶氮产物（—N＝N—）；此化学反应可以生成拥有大拉曼散射截面的生色团，这为增强拉曼检测信号提供了可能。

江西农业大学食品科学与工程学院关琦、颜贤仔、王纯荣*等通过将偶氮偶联反应和SERS结合的方法对His进行检测。以氢氟酸刻蚀法制成的银枝晶为SERS活性基底，并挑选3 种不同的重氮组分分别与His进行偶氮偶联反应，探讨重氮组分种类、固相萃取时间、Na2CO3质量浓度和重氮组分浓度等对衍生化反应产物SERS信号的影响，探出His的检出限，并根据His含量制作标准曲线进行线性拟合分析，又将此方法应用到实际样品检测。

1 SERS基底的结构特征

银枝晶基底是由氢氟酸刻蚀法制备，采用SU8010场发射扫描电子显微镜对银枝晶的表面形貌进行表征。图1显示银枝晶的形貌如树枝状，表面被密集覆盖，有很多潜在的“热点”，在作为SERS活性基底方面有很大的应用潜力。

2 银枝晶基底的稳定性检测

图2中检测结果都是在2-F-PATP浓度为1×10-3 mol/L、Na2CO3质量浓度为6 g/100 mL和固相萃取5 min条件下完成；图2A中15 个基底上均可检测到His偶氮偶联反应后的偶氮产物的2 个特征峰，拉曼光谱强度比较稳定；由图2B可以看到，His偶氮产物在同一基底上特征峰为1432 cm-1处的拉曼光谱强度变化，相对标准差为2.38%，平均强度变化小于10%。以上结果可以表明银枝晶作为SERS基底用于检测His有较好的稳定性。

3 His常规拉曼光谱

如图3所示，His固体拉曼光谱中1092 cm-1处特征峰为面内C—H弯曲振动峰，1178 cm-1处特征峰为C—N伸缩振动峰，1272 cm-1处特征峰为面内C—C弯曲振动峰，1321 cm-1处特征峰来自CH2摇摆。图3中，His溶液浓度为10-3 mol/L，其拉曼光谱检测时使用银枝晶基底。研究显示，His溶液基本检测不到其特征峰拉曼光谱。因此，检测His的拉曼光谱需要改进检测方法。

4 重氮组分的筛选

将同一浓度His分别与3 种重氮组分进行偶氮偶联反应。选取其中出现偶氮产物（—N＝N—）特征峰在1380～1440 cm-1范围内，拉曼光谱指纹图谱清晰，且SERS信号增强效果显著的重氮组分。从图4可以看出，空白银枝晶基底的光谱图接近平线，因此在利用银枝晶基底对His偶氮产物进行检测时没有影响。在3种重氮组分中，3-ABL与His偶氮偶联反应后其产物在1001、1139、1227、1399cm-1和1595cm-1处出现拉曼光谱特征峰。其中，His偶氮产物（—N＝N—）特征峰为1399cm-1，不过该峰的拉曼光谱信号强度较低（图4A）。当3-ACID用作重氮组分与His偶氮偶联反应后在995、1190、1384 cm-1和1589 cm-1处出现拉曼光谱特征峰。其中，His偶氮产物（—N＝N—）特征峰为1384 cm-1，其拉曼光谱信号强度不高，且特征峰不明显（图4B）。2-F-PATP用作重氮组分时，与His偶氮偶联反应后在1064、1209、1246、1335、1387、1432 cm-1和1586 cm-1处出现拉曼光谱特征峰，可以在1387 cm-1和1432 cm-1发现His偶氮产物（—N＝N—）特征峰，且特征峰处的拉曼光谱信号比较显著（图4C）。根据偶氮产物特征峰的拉曼光谱信号强弱以及拉曼指纹图谱形状，最终选取2-F-PATP进行后续研究。

5 固相萃取时间对偶氮产物SERS信号的影响

从图5可以看出，固相萃取时间为5 min时，SERS信号最强，有比较显著的效果，在萃取时间超过5 min后，SERS信号随之减弱，得出固相萃取时间5 min为银枝晶基底浸泡在His偶氮产物的溶液中萃取的适宜条件。

6 Na₂CO₃质量浓度对偶氮产物SERS信号的影响

Na2CO3作用是调节重氮盐溶液酸碱度，其含量对反应有一定影响。图6显示：在5 种不同Na2CO3质量浓度下，都会产生偶氮产物（—N＝N—）的特征峰。根据图6选取特征峰（1387 cm-1和1432 cm-1）的拉曼光强度变化，发现当Na2CO3质量浓度为6 g/100 mL时，SERS信号增强效果最好，因此选取此质量浓度作进一步研究。

7 2-F-PATP浓度对偶氮产物SERS信号的影响

图7显示：在2-F-PATP浓度为0.25×10-3、0.5×10-3 mol/L和4×10-3 mol/L时，均未发现明显的偶氮产物（—N＝N—）的特征峰信号；在2-F-PATP浓度为0.5×10-3、1×10-3 mol/L下，都产生了偶氮产物（—N＝N—）的特征峰信号。其中2-F-PATP浓度为1×10-3 mol/L时SERS信号增强效果更显著。

8 His含量定量分析

用浓度为1×10-3 mol/L的2-F-PATP作为重氮组分与不同浓度（10-21～10-13 mol/L）的His进行偶氮偶联反应，反应中固相萃取时间5 min、Na2CO3质量浓度6 g/100 mL。由图8A可以看出，5 个浓度都可以检测出偶氮产物（—N＝N—）特征峰为1387 cm-1和1432 cm-1的SERS信号，并且随着His浓度增加偶氮产物（—N＝N—）特征峰的SERS信号也有明显增加趋势；图8B和C分别是以His浓度结合特征峰1387 cm-1和1432 cm-1处拉曼光谱强度制作的标准曲线，可以看出特征峰1387 cm-1和1432 cm-1处拉曼光谱强度与His溶液浓度线性相关性良好。线性拟合方程分别为y=173266.3855+7893.8895x和y=178462.959+8115.819x，相关系数R2分别为0.97561和0.96884，均大于0.95，结果说明银枝晶作为SERS基底灵敏度较高，将偶氮偶联反应和SERS结合的方法较可靠，可以用来对微量氨基酸进行定量分析。

9 实际样品中的应用

从图9A～C可以看出，直接检测蛋白并未检测到偶氮产物的特征峰；但在1 mg/L和0.1 mg/L的BSA、HAS和α-LA与2-F-PATP偶氮偶联反应后，都可以检测出偶氮产物的特征峰并且SERS信号显著。GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》中液体样品的His检出限为2.4 mg/L。红富士苹果的蛋白质含量约为3 g/kg，制成的苹果汁稀释105倍后蛋白质质量浓度约为0.015 mg/L，而果汁中His含量远低于该国家标准规定的His检测限。图9D显示，红富士苹果汁没有明显的拉曼光谱，而其稀释105倍后与重氮组分2-F-PATP进行偶联偶联反应仍可以得到显著的His偶氮产物SERS信号。以上研究表明本衍生化方法可以应用到含His的实际样品的检测并且灵敏度较高。

10 结论

建立了SERS与偶氮偶联反应结合快速灵敏检测His的方法。发现在2-F-PATP浓度为1×10-3 mol/L、Na2CO3质量浓度为6 g/100mL，并且固相萃取5min后即可检测到His偶氮产物明显的拉曼光谱指纹图谱，且特征峰拉曼光谱强度较高。本方法检测His的检出限为10-21 mol/L。根据特征峰（1397cm-1和1432cm-1）对His进行定量分析，His浓度与特征峰拉曼光谱强度呈现出良好的线性关系，R2分别为0.97561和0.96884，均大于0.95，具有良好的线性关系。使用本方法可对含有His残基的BSA、HSA、α-LA和苹果汁这些实际样品进行检测。该方法灵敏度较高、操作简便、检出限较低，在实际样品检测中具有良好的应用前景。

本文《基于表面增强拉曼光谱和偶氮偶联反应对组氨酸的灵敏检测》来源于《食品科学》2023年44卷第16期237-242页，作者：关琦，颜贤仔，余莉莉，王翠萍，曾佩，张欢，王纯荣。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220614-145.

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