单杨院士团队：草酸青霉WX-209的安全性评估和全基因组测序，揭示其如何安全有效地降解柑橘囊衣

2023-12-19 22:45:59

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Introduction

在果汁和罐头生产中，去除果肉表皮包裹的囊衣是一大难题。常用的方法包括酸碱法，但会产生囊衣碎片残留物，影响产品的感官和口感，还有物理或机械剥离的方法，但其不仅耗费人力，效率低下，还会破坏果肉完整性。无法满足无害环境和节约资源的需求，许多物理或化学处理已逐渐被生物处理所取代。微生物潜力巨大，因其相对便宜，高效和环保的特性而引起广泛关注。

多种研究已经探索了青霉菌与纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的产生有关，例如P. oxalicum 114-2、P. Arizona、P. echinulatum等。丝状真菌及其主要分泌物，特别是水解酶包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等，可用于食品生产、有机合成、化妆品和动物饲料制造以及各种行业。青霉菌的酶由于其基因组特性而被用于实际应用，草酸青霉菌属经研究有利于产生果胶酶，果胶裂解酶和果胶酯酶等多种酶，并提高葡萄汁，橙汁和苹果汁的产量。

然而，酶法脱皮在食品中并没有得到广泛应用，部分原因是其安全性不能保证或效果不好。在果汁生产中，果皮碎屑或沉淀物的出现会影响果汁澄清度。一些青霉菌属会产生霉菌毒素，其对动物生殖系统有毒，会致癌和致突变。有些酶法脱皮需要结合物理条件才能发挥更好的效果，如机械剥离和真空灌注等。因此，找到一种能够安全有效地达到更好剥离效果的高产复合酶是一项重要的任务。

本文探讨了从生物质废弃物中分离出的草酸青霉WX-209的粗酶液安全性以及其降解柑橘囊衣的能力，并通过全基因组测序预测了其产生酶的基因片段，研究了与纤维素和半纤维素降解相关的基因。这是为了了解用于食品生产过程中的草酸青霉WX-209的酶生产能力。同时，也实现了生物废弃物的综合利用。观察其产生的粗酶液对柑橘囊衣的降解作用，通过动物实验评估粗酶液的安全性，为果蔬生产工艺中低成本、高效、安全的酶去皮法的实现提供了依据。

Results and Discussion

柑橘囊衣降解

如图1所示草酸青霉WX-209粗酶液能有效地降解柑橘囊衣。柑橘囊衣在处理过程中随着时间的推移而溶解和消失，柑橘囊衣的果肉明显暴露（图1A）。如图1B所示，柑橘囊衣的细胞壁在初始结构致密，细胞间隔均匀。10 min后，尽管细胞保持一定的排列顺序，但细胞壁被破坏，细胞间物质减少并且密度降低。20 min后，边缘开始溶解，细胞变形并融合，细胞间质显著溶解。30 min后，细胞失去完整性，细胞内容物泄漏出来。40 min后，细胞分解，纤维变薄并分散。50 min后，剩余的完整囊衣很少。柑橘囊衣主要由纤维素，半纤维素，果胶等组成，这一系列的变化证实了该种粗酶液在柑橘囊衣降解中的有效性，有效地降解了柑橘囊衣的细胞壁，表明它含有相关的降解酶。

图1 草酸青霉WX-209粗酶液在不同时间对柑橘囊衣的降解作用

安全性评价

急性经口毒性试验

为了探讨草酸青霉WX-209所产酶在柑橘罐头加工应用中的安全性，进行了毒理学测试。如图2所示，灌胃粗酶液结束后连续观察14 d小鼠未见异常反应及死亡，试验结束对小鼠进行解剖，肉眼观察主要脏器表面和切面均未见明显异常情况。酶液组与空白对照组比较，给受试物前后动物体质量无明显差异（P＞0.05）；在第4、7、10、14 天，酶液组动物体质量与空白对照组相比，差异不显著（P＞0.05）。

图2 酶溶液对小鼠体质量的影响

小鼠骨髓细胞微核和精子畸形试验

阳性对照组按40mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺，各受试物给粗酶液体积均为20 mL/kg，高剂量组均灌胃给予原液，中剂量组剂量为高剂量的1/2，低剂量组剂量为高剂量的1/4，空白对照组给予纯水。酶液各剂量组小鼠骨髓细胞微核率与空白对照组比较，无显著差异（P＞0.05），阳性对照组与空白对照组比较有显著差异（P＜0.01），各剂量组PCE/NCE比值未小于空白对照组的20%，表明酶液对小鼠骨髓细胞未见明显毒性。酶液各剂量组小鼠精子畸形率分别与空白对照组比较，无显著差异，阳性对照组与空白对照组比较有显著差异（P＜0.01），详见表1，2。

表1 粗酶液对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

表2 粗酶液对小鼠精子畸形发生率的影响

亚慢性毒性试验

进行30 d口服毒理学测试，以评估粗酶液对各器官系统的慢性毒性作用。在喂养的30 d内，酶液组小鼠的生长状况良好。如图3所示，动物体质量、食物利用率、每周总食物利用率均与对照组无显著差异（P＞0.05）。同样，酶溶液组的异常行为和中毒症状、血液学和血液生化指标与对照组相比也没有明显差异（P＞0.05）。尽管中性粒细胞（Neu）和淋巴细胞（Lym）的比例分别略高于和低于对照组，但在正常范围内。肝脏、肾脏、脾脏、睾丸的重量及脏体比值与空白对照组比较无显著差异（P＞0.05）。

图3 大鼠30 d的喂养试验

全基因组测序

全基因组测序和组装

使用PacBio RS系统和Illumina MiSeq技术的组合对草酸青霉WX-209的基因组进行测序。基因组的一般特征的分析如图4所示，最终组装的WX-209的完整基因组序列以36618721个碱基对的基因组大小表示，并组装成45个支架，GC含量为48.33%。100%鉴定的基因在NR数据库中进行了注释，74.84%（8508）和79.52%（9041）的基因分别在Swiss-prot和Pfam数据库中进行了注释。此外，根据COG分析，86.32%（9814）基因被注释为不同的功能类别。根据GO注释，将8270个基因（72.74%）分为三组。根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，4708个基因（41.41%）被划分为不同的代谢途径。

图4 草酸青霉WX-209的基因组图谱（A）以及蛋白质注释维恩图（B）

草酸青霉WX-209所产酶相关的功能基因注释

对WX-209的COG分析将9814个基因分为24个不同的类别，如图5所示。WX-209的主要类别是碳水化合物转运和代谢（G，6.95%），氨基酸转运和代谢（E，5.61%），翻译后修饰，蛋白质转运，表达（O，4.97%），转录（K，4.94%），翻译，核糖体结构和生物合成（J，4.24%），能量产生和转化（C，3.96%），复制，重组和修复（L，3.76%），细胞内运输，分泌和转运（U，3.62%)。特别是，与木质纤维素降解相关的碳水化合物运输和代谢（G）中的基因数量为682个，其中最丰富的COG是COG0176，其对戊糖-磷酸途径中代谢物的平衡很重要，功能注释的高度多样性表明， WX-209具有纤维素降解的潜力。

图5 COG注释

在GO分类分析中，8270个预测蛋白，6369，5143，6150个蛋白与分子功能，细胞成分和生物过程密切相关（图6）。与碳水化合物代谢水解酶相关的GO包括GO：0003824，GO：0016020，GO：0044425，GO：0009987和GO：0008152（对应的基因为gene07610，gene07894，gene08493，gene10012，gene10460，gene10511和gene10711）。基因（gene01275，gene04598，gene05822，gene06325，gene06631，Gene06756，gene07120，gene09398和gene09399）与α-葡萄糖苷酶的功能密切相关。gene00517，gene04336，gene04496，gene05720，gene06654，gene11604和gene11728与β-半乳糖苷酶有关。与β-1,4-木聚糖酶相关的基因包括基因01251，基因03061，基因04288，基因04893，基因05850和基因07094。

图6 GO注释

将4708种蛋白质与KEGG途径对应（图7），46条途径中12条代谢途径（M），12条人类疾病途径（HD），10条有机体系统途径（OS），5条细胞过程途径（CP），4条遗传信息处理途径（GIP）和3条环境信息处理途径（EIP）显着富集。碳水化合物代谢涉及134个基因，包括氨基糖和核苷酸糖代谢（ko00520，41个基因）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500，29个基因）、丙酮酸盐代谢（ko00620，16个基因，戊糖和葡萄糖醛酸相互转化（ko00040，15个基因）和果糖和甘露糖代谢（ko00051，12个基因）。在以前的研究中提到的ko00500与纤维素1,4-β-纤维素生物苷酶的降解和代谢有关。草酸青霉WX-209富含与纤维素酶和木聚糖酶相关的基因，对柑橘囊衣的降解具有良好的作用。通过全基因组测序和功能注释，我们对酶的产生机制有了进一步的理解。

图7 KEGG功能注释

碳水化合物活性酶（CAZy）鉴定

根据蛋白质结构域中氨基酸序列的相似性，活性碳水化合物酶可分为六类：糖苷水解酶类（GHs），糖苷转移酶类（GTs），多糖裂解酶类（PLs），碳水化合物酯酶类（CEs），碳水化合物结合模块（CBMs）和辅助模块酶类（AAs）。草酸青霉CAZymes蛋白质编码基因（PEG）的Blastp分析显示，糖苷水解酶类是最主要的类别（GH，266个基因，44.93%），其次是35个糖基转移酶（GT，125个基因，21.11%），11个碳水化合物酯酶（CE，115个基因，19.43%），13个辅助模块酶（AA，57个基因，9.63%），13个碳水化合物结合模块酶类（CBM，22个基因，3.72%）和6个多糖裂解酶（PL，7个基因，1.18%）参与碳水化合物代谢（图8）。

图8 草酸青霉WX-209完整基因组序列的CAZy注释

Conclusion

本研究以草酸青霉 WX-209为来源的粗酶液对柑橘囊衣的降解有较好的效果，其安全性在动物水平上得到了验证。此外，对草酸青霉WX-209的基因组测序和分析揭示了其纤维素降解的相关基因与功能代谢。

第一作者

胡筱，湖南大学2017级硕士研究生，现为浙江大学2020级博士研究生在读，研究方向为食品科学。曾荣获“2019年硕士研究生国家奖学金”“湖南大学2020届优秀毕业研究生”“湖南大学2018-2019学年优秀研究生”等荣誉称号，目前以第一作者身份发表SCI文章四篇，EI一篇。

第一作者

钱玉娇，湖南大学2019级硕士研究生，湖南省2022届“优秀研究生毕业生”，湖南大学优秀研究生，获得2021年研究生国家奖学金，研究方向为食品营养与安全；天然营养成分与肠道微生物，目前以第一作者身份发表SCI文章三篇。

通信作者

单杨，中国工程院院士，湖南省农业科学院院长，研究员，博士，博士生导师。科技部重点领域创新团队“果蔬加工与质量安全”负责人，柑橘资源综合利用国家地方联合工程实验室和农产品质量安全风险评估实验室（长沙）主任。

37年从事柑橘等果蔬贮藏加工与综合利用基础理论、关键技术研究和工程科技应用与推广，创立连续、清洁和标准化加工技术及基础研究，构建资源高效高值综合利用技术及基础研究，创新开发加工原料绿色贮（冻）藏技术及配套设施。是国家“万人计划”科技创新领军人才和农业农村部“科研杰出人才”。以第一完成人获国家科技进步二等奖2项、中国工程院光华工程科技奖和湖南光召科技奖各1项、湖南省创新团队奖1项、湖南省技术发明一等奖1项、湖南省科技进步一等奖2项，主编著学术著作6部（ELSEVIER英文专著2部），以第一或通讯作者发表论文168篇，第一发明人授权发明专利26件，与企业共同制订出口欧美食品产品标准和技术认证7项。

通信作者

郭佳婧，博士，美国俄克拉荷马大学联合培养，湖南省农业科学院农产品加工研究所单杨院士创新团队核心骨干成员，湖南省青年科技创新人才（荷尖），湖南省农业科学院青年英才。主要研究方向为果蔬副产物综合利用，主持国家自然科学基金、长沙市自然科学基金等科研项目；以第一或通讯作者共发表论文20篇，其中SCI论文17篇；以第一完成人获湖南省农业科学院自然科学一等奖1项，作为重要参与人获湖南省科学技术创新团队奖、湖南省农业科学院自然科学一等奖和湖南省农业科学院科技进步一等奖各1项；获授权专利3项；参编Elsevier国际出版公司英文专著2部。

Safety evaluation and whole genome sequencing for revealing the ability of Penicillium oxalicum WX-209 to safely and effectively degrade citrus segments

Xiao Hu^a,1, Yujiao Qian^a,1, Zhipeng Gao^b, Gaoyang Li^a, Fuhua Fu^a, Jiajing Guo^a,*, Yang Shan^a,*

^a Hunan Agriculture Product Processing Institute, International Joint Lab on Fruits & Vegetables Processing, Quality and Safety, Hunan Key Lab of Fruits & Vegetables Storage, Processing, Quality and Safety, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China

^b College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

¹ Both authors contributed equally.

*Corresponding authors.

Abstract

The microbial potential of Penicillium has received critical attention. The present research aimed to elucidate the efficacy of crude enzyme secreted from Penicillium oxalicum WX-209 in degrading citrus segments and evaluate the safety of the process. Results showed that citrus segment membranes gradually dissolved after treatment with the crude enzyme solution, indicating good degradation capability. No significant differences in body weight, food ingestion rate, hematology, blood biochemistry, and weight changes of different organs were found between the enzyme intake and control groups. Serial experiments showed that the crude enzyme had high biological safety. Moreover, the whole genome of P. oxalicum WX-209 was sequenced by PacBio and Illumina platforms. Twenty-five scaffolds were assembled to generate 36 Mbp size of genome sequence comprising 11 369 predicted genes modeled with a GC content of 48.33 %. A total of 592 genes were annotated to encode enzymes related to carbohydrates, and some degradation enzyme genes were identified in strain P. oxalicum WX-209.

Reference:

HU X, QIAN Y J, GAO Z P, et al. Safety evaluation and whole genome sequencing for revealing the ability of Penicillium oxalicum WX-209 to safely and effectively degrade citrus segments[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2369-2380. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.005.

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