FSHW | 载叶黄素的海藻酸钠基水凝胶对急性结肠炎小鼠肠道炎症及菌群的影响

2023-12-26 23:55:09

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Introduction

炎症性肠病（IBD）是溃疡性结肠炎和克罗恩病的统称，是一种以胃肠道炎症为特征的慢性复发性疾病。IBD主要表现为体重减轻、腹痛、腹泻、发热和厌食等几种症状。虽然IBD的发病机制尚未阐明，但研究表明，现代人不良的饮食和生活方式影响人体肠道的稳态，容易引起肠道屏障功能障碍。当肠道屏障受损时，肠道的通透性可能会增加，容易导致细菌入侵和组织炎症。此外，过量炎性细胞因子的分泌对促进肠道屏障的破坏具有重要作用，与IBD密切相关。大量研究也证实，IBD患者肠道菌群与正常人不同，揭示了IBD与肠道微生物的关系。

目前常用类固醇或免疫调节药物来减轻IBD引起的炎症和免疫反应，以达到缓解症状的目的。但这些药物长期大量使用会引起严重的副作用和并发症，因此临床医学正在积极寻找安全性高的新型药物来预防和治疗IBD。在中药中，植物药材可以有效治疗多种慢性病，且副作用低。因此，大量研究转向天然化合物对 IBD 的治疗和预防作用。在西方民间药方中，万寿菊可用于治疗肠胃相关疾病。研究表明，富含叶黄素的万寿菊乙醇提取物可缓解小鼠溃疡性结肠炎的症状。玉米黄质是叶黄素的结构类似物，研究表明，它是治疗和预防IBD的潜在活性化合物。叶黄素改善IBD的机制主要在于调节促炎细胞因子的分泌、改善氧化应激以及与肠道细菌生态系统的相互作用。

但IBD炎症部位的靶向治疗面临药物溶解性差、生物利用度低等困难；药物稳定性差，易被氧化、水解或异构化等，导致炎症部位药物聚集少，治疗效果不理想。如何提高活性化合物的稳定性、靶向性和递送效率是一个备受关注的问题。有研究证明叶黄素对低pH值和胃肠道中的酶促作用敏感，化学稳定性差，且类异戊二烯的结构使叶黄素易于积聚在肠黏膜中，影响其生物利用度。通常采用纳米化的方法来增加叶黄素在水性体系中的分散性，但外来的机械力或强酸碱环境可能会破坏纳米体系的结构，难以控制叶黄素的释放。将纳米粒子与水凝胶结合用于活性成分的传递已成为研究热点。水凝胶是聚合物通过物理或化学交联形成的具有独特三维网络结构的软质材料，可有效保持亲脂性包封物质的稳定性，并实现其在人体特定部位的缓释。研究表明，黏性聚合物可以延长活性物质在肠道中的停留时间，提高其有效缓解炎症的能力。

江苏省农业科学院宋江峰副研究员课题组在本研究中以葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的发生，分析小鼠结肠组织损伤、粪便血红蛋白含量、血清炎症因子水平和肠道炎症因子表达情况，进一步探讨其缓解作用。同时，通过二代测序分析了负载叶黄素海藻酸钠水凝胶灌胃干预后小鼠粪便菌群分布特征及机体炎症反应与肠道菌群变化的关系。探讨负载叶黄素水凝胶对结肠炎治疗的干预作用，为开发基于水凝胶的叶黄素功能产品提供理论依据。

Results and Discussion

小鼠结肠组织病理学分析

如图1a所示，研究通过苏木精-伊红染色检测小鼠结肠组织的完整性。BLK组小鼠结肠组织有完整的结肠黏膜和杯状细胞，组织中无炎症细胞浸润。DSS组小鼠结肠组织出现明显炎性病变，具体表现为黏膜上皮细胞损伤消失、杯状细胞损伤及细胞间隙扩大、杯状细胞间质炎性细胞浸润、大量炎性细胞浸润在黏膜下层。与DSS组相比，LAH组改善了结肠炎症。杯状细胞损伤少，细胞间隙小，黏膜上皮较完整，无炎性细胞浸润，组织形态与BLK组相似；LUT组杯状细胞畸变，黏膜下层出现少量炎性细胞浸润；LP组黏膜上皮受损，杯状细胞间隙出现炎性细胞；AH组杯状细胞间隙变大，杯状细胞间隙及黏膜下层出现大量炎性细胞浸润。如图1b所示，与BLK组相比，DSS组结肠组织病理学评分显著升高（P＜0.05）。AH组和DSS组的组织病理学评分差异无统计学意义（P＞0.05）。与DSS组相比，LUT组、LP组和LAH组均显着降低组织病理学评分（P＜0.05），其中LAH组更有效。上述结果表明，AH并没有改善肠上皮的完整性，LP在改善结肠组织损伤方面的效果不如LAH，AH和LP结合形成的LAH对肠上皮细胞的保护作用更好。

肠黏膜屏障的破坏可以直接表明结肠炎的严重程度。因此，测定了小鼠结肠组织中肠紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的荧光强度。如图1a所示，与BLK组相比，DSS组紧密连接蛋白的表达明显降低（P＜0.05）。与DSS组相比，LUT、LP、LAH治疗后结肠组织紧密连接蛋白表达明显上调（P＜0.05），AH组差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明叶黄素对肠黏膜损伤有修复作用，但不同叶黄素治疗组的相对荧光强度（图2b）无显著差异（P＞0.05）。

图1 （a）小鼠结肠组织的 H&E 染色和免疫荧光分析；（b）小鼠结肠组织学评分和相对荧光强度的比较

小鼠粪便中血红素含量的变化

如图2所示，BLK组粪便血红素含量接近0，DSS组粪便血红素含量显著高于其他各组（P＜0.05）。DSS组粪便血红素含量随时间逐渐升高，在DSS治疗的最后一天（实验第15天）达到最大值。与DSS组相比，LUT组在第12、13、14和15天分别降低了80%、76%、49% 和28%；LP组分别降低了83%、62%、55%和55%；AH组下降58%、21%、8%和24%；LAH组分别下降82%、73%、54%和62%。很明显，LAH组效果更好。第13、14、15天，LAH组大便血红素显着低于LP组和AH组（P＜0.05），而AH组粪便血红素含量仅次于DSS组并维持在较高水平，说明海藻酸钠水凝胶不能有效抑制肠道出血，但提高了叶黄素纳米粒的抑制作用。

图2 小鼠粪便中的血红素含量

小鼠血清炎症因子水平变化

DSS处理后IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-1β的含量均增加（如图3所示）。与DSS组相比，LUT显着降低IFN-γ、IL-6的含量，LP显着降低IFN-γ、TNF-α和IL-6的含量，AH显着降低了IFN-γ、JEMCP-1和IL-6的含量（P＜0.05）。LAH显着降低上述所有炎症因子的含量（P＜0.05），BLK组炎症因子水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与LUT相比，LAH显著抑制JEMCP-1和TNF-α的含量（P＜0.05）。与LP相比，LAH显著抑制IFN-γ、IL-6和MCP-1的含量（P＜0.05）。与AH相比，LAH显著降低了IFN-γ、IL-1β和TNF-α的含量（P＜0.05）。表明海藻酸钠水凝胶和叶黄素纳米颗粒之间可能存在协同作用以降低血清中炎症因子的水平。

图3 小鼠血清炎症因子水平

小鼠肠道菌群

如图4所示，每只小鼠的粪便微生物群在门水平上主要由放线菌门、拟杆菌门、念珠菌门、蓝细菌/叶绿体、去铁杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、细线菌门、疣微菌门和未指定菌门组成。主要的优势微生物群是拟杆菌门和厚壁菌门，以及少量的变形菌门，它们合计占粪便微生物群的90%以上。与BLK组相比，DSS组显著增加了粪便微生物群中疣微菌的相对丰度。与DSS组相比，AH组疣微菌相对丰度进一步增加，占7.45%，高于其他组。与DSS组相比，LAH组、LUT组和AH组变形菌门的相对丰度显着降低。与DSS组相比，其余优势菌群差异无统计学意义（P＞0.05）。

由于只有少数门在门水平上有显着差异，因此在门水平上分析了每组小鼠的粪便微生物群分布。如图4所示，相对丰度最大的13个科水平上物种分别是紫单孢菌科（Porphyromonadaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、韦荣球菌科（Erysipelotrichaceae）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）、脱铁杆菌科（Deferribacteraceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、萨特菌科（Sutterellaceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）和螺旋杆菌科（Helicobacteraceae）。与BLK组相比，DSS组显着降低了Rikenellaceae、Eysipelotrichaceae和Clostridiales_Incertae_Sedis_XIII的相对丰度，显著提高Ruminococcaceae、Bacteroidaceae、Verrucomicrobiaceae、Deferribacteraceae和Helicobacteraceae的相对丰度，其它组均显著提高了Bacteroidaceae的相对丰度。与DSS组相比，LAH组显着降低了Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Desulfovibrionaceae的相对丰度，显著增加了Rikenellaceae和Eysipelotrichaceae的相对丰度；LP组显着降低了Deferribacteraceae的相对丰度，显著增加了Prevotellaceae、Rikenellaceae和Erysipelotrichaceae的相对丰度。LUT组显着降低了脱硫弧菌科和Coriobacteriaceae的相对丰度，增加了Rikenellaceae的相对丰度；AH组显着降低了Rikenellaceae、Verrucomicrobiaceae和Bifidobacteriaceae的相对丰度，显着增加了瘤胃球菌科、Deferribacteraceae、Deferribacteraceae和Bifidobacteriaceae的相对丰度。

图4 小鼠肠道菌群的组成分析

Conclusion

负载叶黄素的海藻酸钠水凝胶通过降低粪便血红素含量、结肠组织损伤和炎症因子水平来改善小鼠 DSS诱导的结肠炎症状。实验结果表明，与叶黄素和叶黄素纳米颗粒相比，负载叶黄素的水凝胶在缓解结肠炎方面更有效。水凝胶载体避免了叶黄素纳米颗粒在胃酸环境中的早期释放，减少了叶黄素在胃中的流失；它还通过缓慢释放叶黄素纳米颗粒，以维持肠道中叶黄素的浓度，更好地发挥其药理活性。此外，叶黄素水凝胶通过增强ZO-1、claudin-1和Occludin的表达，抑制NF-κB通路降低包括TNF-α、iNOS、NLRP3和IL-1β在内的炎症因子的表达和分泌维持肠道屏障的完整性，从而达到缓解DSS诱发结肠炎的目的。叶黄素水凝胶还通过调节Desulfovibrionaceae，Erysipelotrichaceae和Rikenellaceae的相对丰度来调节肠道微生物群的生态失衡。基于海藻酸钠水凝胶的递送系统可能会增强叶黄素和肠道微生物群之间的相互作用，从而调节结肠炎症。

第一作者

徐鹏翔，硕士，主要从事营养物质靶向递送的研究，其研究成果发表在International Journal of Biological Macromolecules，Journal of Food Processing and Preservation等杂志上。

第一作者

罗树伟，南京林业大学2020级硕士研究生，主要从事功能性食品开发及营养物质靶向递送，其研究成果发表在Food Chemistry，International Journal of Food Science and Technology等杂志上。

通信作者

宋江峰，工学博士，美国北卡农工州立大学博士后，江苏省农业科学院副研究员，硕士生导师。入选江苏省333高层次人才、省现代农业产业技术体系基地主任、省农科院青年拔尖人才、省科技副总等。主要从事植物源农产品加工功能品质调控及副产物增值利用，类胡萝卜素等营养健康食品智造研究。主持或承担国家自然科学基金项目、国家公益性行业(农业)科研专项、江苏省重点研发计划重点项目等15项部省级课题。获授权国家专利28件（包括国际专利4件）、研制省及团体标准27项；发表论文180多篇，其中SCI收录60多篇，参编著作3部。主持获江苏省科学技术三等奖、中国食品工业协会科学技术特等奖、省农科院科学技术二等奖，以第2完成人获河南省科学技术二等奖、神农中华农业科技三等奖等10多项省部级、行业奖。与30多家省级龙头、高成长性中小企业建立良好的产研合作关系，多项植物源农产品提质增效加工与营养健康食品制造技术实现转化应用。

Effect of sodium alginate-based hydrogel loaded with lutein on gut microbiota and inflammatory response in DSS-induced colitis mice

Pengxiang Xu^a,b,1, Shuwei Luo^a,b,1, Jiangfeng Song^a,b,*, Zhuqing Dai^a, Dajing Li^a, Cai’e Wu^a

^a Institute of Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China

^b College of Light Industry and Food Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

¹ Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

In order to effectively deliver lutein to the inflamed colon and better exert its pharmacological activity, this paper constructed a sodium alginate hydrogel-based delivery system loaded with lutein nanoparticles, evaluated the regulation on the expression and secretion of related inflammatory factors in mice with colitis, and its impact on intestinal microbial environment. The results showed that comparing lutein crystal and its nanoparticle, lutein hydrogel alleviated dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice more effectively by adjusting fecal heme content, colon tissue damage, and inflammatory factor levels. Moreover, lutein hydrogel increased the expression of intestinal tight junction proteins zonula occluden-1 (ZO-1), claudin-1 and occludin to maintain the integrity of the intestinal-barrier, inhibited the nuclear factor-κB (NF-κB) pathway and reduced expression and secretion of inflammatory factors including tumour necrosis factor-α (TNF-α), inducible nitric oxide synthase (iNOS), NOD-like receptors 3 (NLRP3) and interleukin-1β (IL-1β). In addition, the intestinal microbial environment of mice with colitis was improved by down-regulating the relative abundance of Desulfovibrionaceae and up-regulating the relative abundance of Erysipelotrichaceae and Rikenellaceae. As a slow-release carrier to load lutein nanoparticles, sodium alginate-based hydrogel has potential application prospect.

Reference:

XU P X, LUO S W, SONG J F, et al. Effect of sodium alginate-based hydrogel loaded with lutein on gut microbiota and inflammatory response in DSS-induced colitis mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2428-2439. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.010.

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