中国检验检疫科学研究院陈颖研究员等：转基因大豆低水平混杂定量检测及其不确定度分析

2023-12-29 00:05:32

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转基因产品低水平混杂（LLP），即生产、贸易及加工的农产品中，因各种原因导致含有较低或极低水平未经进口国批准的转基因成分。在农产品供应链的多个节点上，转基因产品都可能混杂的可能性，因此转基因作物LLP从客观上无法避免。建立科学的转基因大豆LLP判定方法，尤其是定量分析方法，将农产品贸易中的转基因健康及环境风险降到最低，可以保障我国农产品进出口的稳定与进一步的发展。

近年来数字PCR技术被广泛应用于转基因检测，数字PCR由于具有测量独立性与无需任何校准物的特点，使得低丰度靶标分子的精准定量成为可能。但任何检测结果都会或多或少偏离真实值，因此在描述转基因定量结果的同时指出定量结果的可靠程度非常有必要。CNASCL01-G003:2021《测量不确定度的要求》规定，检验实验室应对每项有数值要求的测量结果进行测量不确定度评定。

中国检验检疫科学研究院的邓婷婷、黄文胜、陈颖*等开展转基因大豆GTS-40-3-2低水平混杂定量检测及其不确定度研究。采用数字PCR方法研究从转基因产品LLP定量的整个过程并科学评估定量结果的不确定度，建立科学的LLP判定方法，减少LLP贸易风险，对我国转基因产品进出口贸易具有极为重要的意义。

1 real-time PCR检测模板添加量和定性检测限

将含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%转基因大豆GTS-4-3-2的样品基因组DNA模板10、100 ng及1000 ng加入real-time PCR扩增体系中扩增时，每个扩增反应中添加的内参照黄牛DNA均被检出且Ct值无显著差异（P＞0.05），表明即使扩增体系中DNA模板含量高达1000 ng，PCR也未受抑制。含0.1%和0.05%转基因大豆GTS-4-3-2的样品分别添加10 ng和100 ng模板即可检出。含0.01%转基因大豆GTS-4-3-2的样品需要将模板量添加至1000 ng时才可检出GTS-4-3-2品系特异性基因，而低于此含量后，0.005%和0.001%的样品GTS-4-3-2品系特异性基因检出率极低（表2）。即95%置信区间下，当模板添加量为1000 ng时，LLP转基因大豆GTS-4-3-2的realtime PCR定性检测限为0.01%，低于其他报道中的realtime PCR检测方法。表明即使扩增体系中DNA模板含量高达，PCR也未受抑制。

2 数字PCR的定性检测限和定量检测限

分别对含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%转基因大豆GTS-4-3-2的样品进行数字PCR定量时，在内外源基因阴性对照及空白对照无扩增的情况下，所有转基因大豆GTS-4-3-2样品Lectin基因定量结果的3 次重复RSD值均在5%以内，表明所有操作精密度较好，定量结果较为可靠。含0.1%转基因大豆GTS-4-3-2样品定量结果为0.104%，相对误差和3 次重复RSD分别为4.015%和18.533%，小于目前国际通用的定量方法要求。含0.05%转基因大豆GTS-4-3-2样品的相对误差和3 次重复RSD分别为42.305%和61.171%，不符合转基因定量中相对误差在25%以内的要求，结果仅可作为样品中转基因大豆GTS-4-3-2品系LLP的含量参考。而3 次重复定量的0.01%样品均出现阳性结果（表3）。表明本研究建立的数字PCR方法对LLP转基因大豆GTS-40-3-2样品的定量检测灵敏度可达0.1%，定性检测限则可达0.01%。

3 数字PCR定量方法的精密度和重复性

为验证所建立的ddPCR方法对低含量转基因大豆的定量检测精密度，在重复性条件下，用同样的方法、相同的测试环境下，很短的时间间隔内得到测试结果的相关数据，每个样品平行检测6 次。含0.1%转基因大豆GTS-4-3-2六个平行样品的定量结果分别为0.102%、0.081%、0.104%、0.112%、0.094%和0.118%，所有样品的3 次重复RSD在11.28%～22.75%之间，与实际含量的相对误差值在-10.55%～24.12%之间（图1a）。

含0.1%转基因大豆GTS-4-3-2样品的相对误差和RSD均小于常规定量要求的25%，表明该方法即使在对低含量的样品进行重复定量时，其精密度和稳定性均较为理想。含0.05%转基因大豆GTS-4-3-2六个平行样品定量结果分别为0.026%、0.063%、0.046%、0.025%、0.033%、0.027%、0.034%，所有样品的3 次重复RSD在43.98%～67.54%之间，与实际含量值的偏差在-50.00%～26.00%之间（图1b），定量精密度和定量值波动范围超过国际通用定量要求，但在日常可操作的前提下，也可实现半定量，对LLP样品的筛查检测和出入境贸易可以提供一定参考依据。

4 转基因大豆GTS-40-3-2LLP定量的不确定度

日常可接受的操作范围内，本研究分别对质量分数不小于0.1%和0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2样品进行LLP定量研究，因此以下将分开计算这两种不同含量样品的定量不确定度。

根据ISO导则35、ISO/TS 21748:2017和我国相关标准，对转基因产品LLP检测的不确定度进行评定。转基因产品LLP定量检测过程带来的合成不确定度由两部分组成，第一部分是通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出的A类不确定度；第二部分是通过对测量影响因素的分析，以非统计分析方法评定的B类不确定度。

4.1 A类不确定度

由于数字PCR为终点计数的绝对定量，传统realtime PCR定量方法中需考虑的内外源基因标准曲线不确定度、样品批内Ct值不确定度、PCR扩增效率的不确定度等都无需考虑。因此其A类不确定度表示为：

式中：μa为标准不确定度；

为n 次含量测定值的算术平均数，n≥6；x为每次含量测定值；i为测定序号；n为平行测量次数。

由2.4节可计算出6 次重复的含0.1%转基因大豆GTS-40-3-2定量的A类相对不确定度uAr0.1%为0.1152，而6 次重复的0.05%转基因大豆GTS-40-3-2定量的A类相对不确定度应uAr0.05%为0.5359。

4.2 B类相对不确定度

采用的数字PCR仪器为Bio-Rad QX200微滴式数字PCR，因此B类不确定度的来源主要有微滴体积引入的测量不确定度、配制样品时天平变动性引入的不确定度、数字PCR仪器校准引入的不确定度。、

微滴体积引入的测量不确定度

本研究采用的数字PCR仪器微滴体积引入的测量不确定度u体积为常数1.40%。

配制样品时天平变动性引入的不确定度

天平变动性产生的不确定度：由天平的检定证书可知其变动性为0.1 mg，按照矩形分布，则

样品净质量为2 次称量操作所得。每次称质量均为独立观测结果，故计算两次为：

天平的最大允差产生的不确定度：由天平检定证书可知其最大允差为0.15 mg，按照矩形分布，则u1最大允差同样，样品净质量为两次称量操作所得。每1 次称质量均为独立观测结果，故计算两次为：

称量10、1、0.5 g大豆产生的相对不确定度分别为：

合成称量产生的相对不确定度：

数字PCR仪器校准引入的不确定度

根据仪器校准证书可知，本实验所用的Bio-Rad QX200微滴式数字PCR校准不确定度u校准为2.03%。

本研究中数字PCR定量GTS40-3-2的B类不确定度由上述3 个分量组成，其合成标准不确定度则表示为：

0.1%及以上转基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相对不确定度应为：

含0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相对不确定度应为：

取包含因子k=2（置信区间95%），则结果报告为0.1%转基因大豆GTS-40-3-2定量扩展不确定度为23.56%，0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2定量的扩展不确定度为107.29%。

结论与讨论

有效的转基因成分定量检测方法无疑是对转基因大豆进行LLP检测和实施标识制度最直接的技术保障。数字PCR步骤繁琐，检测通量比real-time PCR低，因此在转基因成分定性检测中，仍然不及real-time PCR优势明显。但数字PCR技术由于将含有DNA模板的微量样品进行稀释以及分液，分布到大量的独立反应室中进行扩增，极大降低了反应间的相互抑制，提高了反应效率。数字PCR可以对样品进行绝对定量分析，比real-time PCR仅依靠标准曲线确定转基因成分含量更加准确。因此，本研究开展了从DNA提取到定量全过程的系统性转基因大豆GTS-40-3-2的LLP检测研究，定性检测样品中的转基因LLP时仍然推荐real-time PCR方法，定性检测限基本与数字PCR一致，可低至0.01%。定量检测时数字PCR优势明显，可对含0.1%转基因的样品进行准确定量，即使是低至0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2样品仍可进行半定量，其定性和定量灵敏度低于已发表文章中的检测限，也低于国内外的现行标识最低阈值。且本研究采用的检测方法对实验室和人员要求较为宽松，因此建立的定量方法在转基因大豆GTS-40-3-2的LLP检测中具有比realtime PCR更大的实际应用价值。

对于LLP的定量检测，实验中考虑测量值的不确定度非常有必要。采用数字PCR检测时，不受标准样品、内外源基因拷贝数、标准曲线及PCR扩增效率的不确定度影响，因而定量结果更为可靠。本研究对0.1%和0.05%的GTS-40-3-2品系转基因大豆原料进行定量检测的扩展不确定度分别为23.56%和107.29%。在实际检测中，若样品为加工食品时，则还需考虑样品的基质效应及食品加工过程中带来的DNA断裂、降解等产生的不确定度。对于这些因素，目前的科学手段还无法描述，因此在实际检测过程中，难以给出加工食品LLP定量的不确定度。

作者简介

通信作者：

陈颖，中国检验检疫科学研究院副院长兼总工，二级研究员/博士生导师，研究方向为食品质量安全表征及溯源，国家级高层次人才，国务院政府特贴专家，全国三八红旗手，全国先进工作者，全国优秀科技工作者。中国科协第九届全委会委员，中国食品科学技术学会常务理事、食品真实性与溯源分会副主任委员、食品安全与标准技术分会副主任委员，食品安全国家标准审评委员会委员，国家食品安全风险评估专家委员会，国家农业转基因生物安全委员会委员，中国食品法典专家咨询委员会委员，国家健康科普专家库第一批专家，全国标准样品技术委员会（TC118）、全国生化检测标准化委员会（TC387）及全国感官分析标准化技术委员会（TC566）副主任委员，国家标准技术审评专家咨询委员会委员，ISO/TC 34/ SC9工作组专家。“十三五”国家科技创新规划和食品产业科技创新规划编写专家，国家第六次技术预测和2021-2035年国家中长期科技发展规划食品产业科技编写专家。国家重点研发计划“食品安全关键技术研发”重点专项总体专家组专家，《Journal of Agricultural and Food Chemistry》和《食品科学》等学术期刊编委，《食品质量安全检测学报》副主编。江南大学、中国农业大学、北京工商大学等学校客座教授。近年来承担国家自然科学基金、863计划、国家科技支撑计划、国家重大专项、“十三五”国家重点研发计划、欧盟2020地平线项目、中国工程院咨询项目、行业公益科研项目等50余项国家级和省部级科研项目和课题；获得国家科技进步二等奖 2 项，省部级一等奖5项，二等奖10 项；起草国家标准12 项，行业标准133 项；获授权专利及软著63 件；编写专著22 部，其中主编7 部；发表文章357 篇，以第一作者和通讯作者发表 SCI 及EI 文章126 篇。

第一作者：

邓婷婷，中国检验检疫科学研究院研究员，研究方向为食品真伪鉴别及转基因食品检测安全性评价。国际标准化组织ISO/TC34/SC16注册专家，全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC421) 委员，国家标准技术审评中心评估专家，中国检验检测学会科普工作委员会委员。《质量安全与检验检测》杂志编委，《Journal of Food Composition and Analysis》、《食品质量安全检测学报》等审稿专家。担任教育部首批中小学质量教育社会实践基地授课教师。2016年获全国科普讲解大赛优秀奖，2022年获市场监管总局“青年学习标兵”称号。近年来主持及参与国家级和省部级科研项目15 项；获省部级科技奖励4项，国家级社会团体奖4项；近5年来发表SCI或EI文章15 篇；主编或参编中英文专著10 部；参与制定国家标准或行业标准47 项，获得授权国家发明专利15 项。

本文《转基因大豆低水平混杂定量检测及其不确定度分析》来源于《食品科学》2023年44卷第16期318-323页，作者：邓婷婷，黄文胜，曹际娟，于宁，邢冉冉，张九凯，葛毅强，陈颖。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220921-211。

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