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—— 中国食品杂志社
目的:构建小牛凝乳酶原乳酸克鲁维酵母分泌型表达载体,表达重组凝乳酶原。方法:通过PCR获得小牛凝乳酶原cDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pKLAC1α结合因子分泌信号下游,得到重组载体pKLAC1-prochymosin。SacⅡ线性化后氯化锂转化乳酸克鲁维酵母GG799,用含5mmol/L乙酰胺的YCB固体培养基筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因,利用特异性引物筛选多拷贝转化子。阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做TricineSDS-PAGE分析并检测凝乳酶的活力,通过检测阳性转化子产凝乳酶的活力考察其遗传稳定性。结果:经测序及PCR证实,凝乳酶原cDNA准确插入酵母表达载体pKLAC1中,转化后重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中。TricineSDS-PAGE分析证明凝乳酶的分子量约为36kD,酸处理后测得培养基中凝乳酶的酶活为83SU/ml,阳性转化子遗传稳定性好。结论:成功构建出酵母表达载体pKLAC1-prochymosin,在培养基中获得分泌的重组凝乳酶原,经过酸处理后凝乳酶原转化为有活性的凝乳酶。
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