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—— 中国食品杂志社
针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状，将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N）在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达，通过信号肽替换对其编码区进行改造，利用杂合启动子PnaII及营养缺陷标记pyrG构建表达载体，并基于规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略，获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株，重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11 701.2 U/mL，比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力（2 476.0 U/mL）提高了约3.7 倍。此外，通过融合6×His标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化，并对其进行了酶学性质研究：蛋白质大小约为35.0 kDa，重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5，最适温度为65 ℃。综上所述，本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达。
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