J. Future Foods | 采用UPLC串联Q-Exactive质谱和多变量数据分析的代谢组

2023-09-12 18:46:11

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Introduction

牛奶是一种营养丰富的食物，包括蛋白质、脂肪、维生素和矿物质，以及塑造人体肠道菌群组成和调节胃肠道生理的生物活性成分。然而，由于其高营养含量和低酸度，牛奶也是微生物生长的理想物质，这导致其易腐烂。因此，热处理已成为通过抑制微生物生长来延长牛奶保质期的常见做法。巴氏杀菌和超高温（UHT）处理是最广泛使用的商业热处理方法，而行业参数差别很大。

热处理有两个方面。随着温度的升高，安全性会提高，然而，在严酷的加热条件下，牛奶中不可避免地会发生一些变性，例如盐分配、乳清蛋白变性和美拉德反应，这可能会损害牛奶的化学营养和感官品质。因此，人们普遍认为巴氏杀菌牛奶的质量高于超高温杀菌牛奶。由于保质期短，运输成本高，巴氏杀菌牛奶的价格往往高于超高温杀菌牛奶。

牛奶商品的热负荷评估方法的开发一直是一个重要的任务，因为有可能以更高的价格将劣质商品（如过热的牛奶）虚假地标记为优质商品（如巴氏杀菌牛奶）。一般来说，大多数众所周知的参考文献和官方方法都是基于单一生化指标的定性检测。单一的热指示方式通常不能有效地描述牛奶中热诱导的变化。因此，有必要采取一种更全面、更灵敏的方法对热处理奶进行分类。组学，包括代谢组学、多肽组学和脂体组学，是全面研究加热过程中各种因素如何影响牛奶总体组成的有效方法，近年来得到了越来越多的应用。

在这项研究中开发了一种代谢组学方法来整体区分加热到不同温度的牛乳样品，即超高效液相色谱（UPLC）串联Q-Exactive质谱仪和多变量数据分析。

Results and Discussion

不同热加工温度下牛奶的非靶向代谢组学分析

温度升高对牛奶的的影响

通过对LC-MS分析中汇集的数据进行多变量建模，全面覆盖了温度对牛奶样品化学成分的影响。不同热处理温度下的牛奶样品的总离子色谱图（TICS）如图1所示。共鉴定了1811个LC-MS信号，选择了1610个符合组变异系数（CV）＜20%的化合物，以确保数据的可靠性。根据过滤后的数据进行偏最小二乘分析。如图2所示，根据热处理温度的不同，牛乳样品被划分为不同的类群，同一处理间的重复序列聚在一起，说明了不同处理间的生物学差异。

在加热开始时（60～70 °C），样品主要分布在第四象限。随着温度升高到110 °C左右，样品逐步向左上角移动，最终悬浮在负X轴周围。相比之下，在120～150 °C的加热区，样品从原点附近几乎直线向右移动了相对较长的距离，最后停在第一象限。这反映出牛奶的成分发生了显著的变化，以120 °C为界，这可能会受到高温下发生的特定化学反应的影响

图1 牛奶样品在不同热处理温度下的TIC图

图2 用偏最小二乘法分析牛奶样品中温度引起的代谢物的变化

温度响应型SCM标识

正如前面提到的，区分巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶在食品监管和执法方面一直是一个挑战。考虑到欧盟和中国法规的相同规定，加热温度分别为70～80和130～140 °C的牛奶样品与巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶最相似。因此，将70 ℃和80 ℃加热组的样品合并为一组巴氏杀菌牛奶，同时将130 ℃和140 ℃的样品合并为另一组UHT牛奶进行OPLS-DA。

代表巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶的样品在积分图（图3A）中得到很好的分离，R²Y_cum和Q²_cum的值分别为0.999和0.983，表现出良好的适用性和预测能力。在DmodX图中，变量的加权残差不超过2.5（图3C），这表明没有发现异常值，巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶的分离是显著的。霍特林的T2图（图3D）进一步确保了这一点，在该图中，所有样本都被限制在95%的T2 CRT以内。VIP值用来表示变量对分类的贡献。VIP＞1且P＜0.05的化合物通常被认为是SCM。在S小区中，对274个SCM进行了筛选和着色（图3B）。其中UHT牛奶含量高的有239份，巴氏杀菌牛奶含量高的有35份。

图3 代表巴氏杀菌牛奶（蓝色）和超高温杀菌牛奶（绿色）的OPLS-DA图

鉴于市场上普遍存在超高温杀菌牛奶违规模拟的情况，主要对超高温杀菌牛奶的供应链管理机制感兴趣。与巴氏杀菌处理相比，UHT处理过程中蛋白质分解导致游离氨基酸（AA）的释放增加，包括胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、缬氨酸和谷氨酰S-甲基半胱氨酸等肽的释放。游离氨基酸和多肽的衍生物也占了SCM的相当大的比例。

不同热加工温度下牛奶的靶向代谢组学分析

在非靶向代谢组学分析中，有几个AGEs被确认为SCM，因此通过靶向代谢组学分析进一步对它们进行定性和定量，以确定热处理温度对这些代谢物的影响。一般说来，AGEs分为两类：一类是荧光交联物，如戊苷糖；另一类是非荧光非交联物，如CML和吡咯素。本文选取了食品中普遍存在的9种具有代表性的AGE，分析了它们的浓度随加热温度的变化。

AGES和LAL检测

在正离子模式下，从牛奶样品中鉴定出LAL和4种AGE，包括CML、CEL、PETODINE和Prrraline。通过MS/MS裂解鉴定了5个化合物的结构特征（表1）。所有母体离子的m/z偏差均小于δ 3.5，所有碎片离子的m/z偏差均小于δ 10。

表1 正电离模式下加热牛奶中AGEs和LAL的质谱数据

对于CML，m/z 116.0709处的碎片离子是通过准分子离子[M+H]⁺失去-CH₂CH₂（NH₂）COOH而产生的，进一步脱水到m/z 98.0604。然而，这些片段也可能来自CML的异构体，如n-羧甲基赖氨酸或ε-羧甲基赖氨酸，这阻碍了对结构式的确认。据报道，在高温下加工的牛奶中CML浓度特别高。因此，可以合理地假设CML是该化合物的首选结构。

对于CEL，质子化首先发生在羧乙胺部分的羧基上，形成准分子离子（m/z 219.1340），然后脱水生成m/z 201.1235处的碎片离子。另一种断裂方式是质子化发生在赖氨酸部分的羧基上，然后失去-COOH₂⁺。与CML类似，CEL-MS/MS谱图中的碎片也可来自其异构体，然而，基于牛奶和奶制品中CEL的浓度比先前研究报告的其他构型相对较高，假设该化合物为CEL。

对于LaL，2-氨基-2-羧乙基可以从其[M+H]⁺加合物上脱落，形成m/z为147.1128的碎片离子。或者，主链上的C和N原子发生诱导解离，形成m/z 130.0865。片断m/z 216.1350和m/z 198.1231分别由一次和两次脱水产生。m/z 101.1077片段是由主链两边的2-氨基-2-羧乙基的脱羧基和丢失产生的（图3）。对于戊苷糖，碎片^m/z 361.1957是由[M+H]⁺（m/z 379.2073）脱水生成的。

AGEs和LAL的相对量化

CML、CEL、LAL、戊糖苷和吡咯素的含量随温度升高而变化，如图4所示。CML和CEL的变化趋势相似。牛奶中这两种化合物的含量在加热到60 °C之前没有显著变化，而在90 °C下，与未加热的样品相比，CML和CEL的含量分别上升了4.48倍和3.35倍。在90～100 °C温度下，CML和CEL分别是未加热样品的8.93倍和6.96倍。结果表明，CML/CEL生产的最佳温度范围为90～100 ℃。CML和CEL含量的缓慢上升趋势在120 ℃时达到峰值，分别是未加热样品的10.49倍和7.90倍。当温度升高到150 ℃时，CML和CEL的含量都呈现下降趋势，这可能是由于这两种化合物在超高温下的分解所致。CML和CEL的最终相对含量分别是未加热样品的6.09倍和5.13倍。

图4 牛奶中（A）CML、（B）CEL、（C）LAL、（D）戊糖苷和（E）吡咯在25～150 ℃热加工温度下的丰度变化趋势

加热对LAL含量的影响在70°C之前不显著，但随着温度的升高，LAL的含量显著增加，尤其是在110～120 °C期间，LAL的含量显著增加，是未加热牛奶的4.32～7.12倍。而LAL的含量随着温度的升高而下降，在150℃时最终下降到2.03倍。

80 ℃后，牛奶中的戊苷糖含量显著增加，90 ℃和100 ℃时的含量分别为未加热牛奶的4.39倍和7.08倍。与上述CML、CEL和LAL含量不同的是，在100～140 ℃温度范围内，戊苷糖的含量一直保持在较高且稳定的水平，说明戊二醛的生成反应和破裂反应是平衡的。温度高于140 ℃时，戊苷糖的含量略有下降，150 ℃时最高含量为4.93倍。吡咯含量的变化呈现出与上述化合物完全不同的特征。在60～130°C温度范围内，吡咯素的含量出现了较小的波浪式上升，与未加热的牛奶相比，吡咯素的含量从1.15增加到8.78倍。值得注意的是，吡咯的峰从130 ℃开始，这与以前的研究一致，随后在140 ℃时达到23.48倍，在150 ℃时达到28.72倍，这反映了吡咯不像其他4种化合物那样对温度敏感。

总体而言，本研究首次描述了牛奶中几种AGEs，即CML、CEL、戊苷糖、吡咯素、LAL含量随加工温度的变化规律，以及它们产生的最适温度。

区分巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶的预测规则

根据先前的经验，AGEs和LAL可以指示美拉德反应的程度。因此，许多研究人员提出将它们作为牛奶和其他乳制品热处理严重程度的潜在标志物。然而，巴氏杀菌乳和超高温杀菌乳的鉴别方法至今鲜有提出。AGES的成功应用之一是中国国家农业行业标准NY/T939-2016，用于鉴定巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶中的重组奶。根据这一标准，本研究提出了一种区分巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶的方法。

比较了5种化合物的生成和降解速率，发现每种化合物都有独特的动力学曲线响应温度。如前所述，产生化学发光和化学发光的最佳温度范围是90～100 °C，LAL的最佳温度范围是110～120 °C，戊苷糖的最佳温度范围是80～100 °C，吡咯素的最佳温度范围是130～140 °C。

因此，可以利用这些化合物在选定温度下的含量差异。如前所述，加热温度为70～80 °C和130～140 °C的牛奶样品分别被假定为巴氏杀菌牛奶和超高温牛奶。表2总结了评估牛奶热加工的预测规则。重要的是要注意到，这条规则是针对全脂牛奶。对于其他类型的液态奶，它们不同的脂肪、蛋白质和还原糖水平将导致辨别失败。

表2 基于AGEs关系的巴氏灭菌奶与超高温灭菌奶的判别规则

这项工作首次证明了所分析的三种AGE（CML、CEL和戊苷糖）有可能被选作区分巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶的标记。然而，方法的发展与其实际应用之间存在一定的差距。

Conclusion

在本研究中，开发了一种非靶向代谢组学方法，将超高效液相色谱-高分辨率质谱仪和多元统计分析相结合，对不同热加工温度（60～150 °C）下的牛乳进行了表征。在比较代表巴氏杀菌和超高温杀菌的两个临界温度范围（分别为70～80和130～140 °C）的化学成分的基础上，进一步确定了5个潜在的标志物，即CML、CEL、戊苷糖、吡咯素和LAL，并充分展示了它们在牛奶中的含量随温度的变化。此外，基于所选标记中的一定比例，尝试提出区分巴氏杀菌牛奶和超高温杀菌牛奶的预测规则。

A metabolomics approach for monitoring thermal processing temperature of bovine milk using ultra-performance liquid chromatography tandem Q-Exactive mass spectrometry and multivariate data analysis

Yun Xie^a,b, Xuemei Nie^a,b, Chang Wang^a,b, Xiuli Xu^a,b,*, Feng Zhang^a,b,*

^a Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China

^b Key Laboratory of Food Quality and Safety for State Market Regulation, Chinese Academy of Inspection & Quarantine, Beijing 100176, China

*Corresponding authors.

Abstract

Due to the lack of effective assessment method, overheated milk commodities are often marketed as pasteurized milk on the market, which was sold in high price by fraud. Thus, this article aims to establish an approach based on metabolomics to monitor thermal processing temperature of bovine milk. Metabolomics data of bovine milk samples heated at temperatures ranging from 60 °C to 150 °C were achieved by ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) platform, followed by multivariate data analysis. A regular variation pattern of chemical composition as temperature rises was pictured, furthermore, N^ε-carboxymethyl lysine (CML), N^ε-carboxyethyl lysine (CEL), pentosidine, pyrraline and lysinoalanine (LAL) were identified as 5 of the most contributed compounds to discriminate pasteurized and ultra-high-temperature (UHT) milk. By the comprehensive study on their content changes, we concluded that the optimal temperature range was 90−100 °C for the generation of CML and CEL in this experiment, moreover, 110−120 °C for LAL, 80−100 °C for pentosidine and 130−140 °C for pyrraline. Finally, a predicted rule to discriminate pasteurized and UHT milk was preliminarily established based on the ratios of CML/CEL, CEL/pentosidine and CML/pentosidine, which could be applied in food labelling authentication of commercial bovine milk after further validation.

Reference:

XIE Y, NIE X M, WANG C, et al. A metabolomics approach for monitoring thermal processing temperature of bovine milk using ultra-performance liquid chromatography tandem Q-Exactive mass spectrometry and multivariate data analysis[J]. Journal of Future Foods, 2024, 4(1): 83-90. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.05.005.

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