食品安全是全球主要的公共卫生问题,常见的食品污染物主要包括农药和兽药残留、非法添加剂、重金属离子、过敏原、霉菌毒素和微生物等。目前,食品中有害物质的常规分析方法主要包括气相色谱、高效液相色谱、质谱、液相色谱-质谱联用、聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附测试(ELISA)和免疫层析测定等。与传统检测方法相比,基于荧光的分析方法在便携式传感和检测领域表现出巨大潜力。
1 碳量子点概述
碳点由于其纳米结构的多样性而难以准确定义和分类。根据碳纳米结构的多样性将碳点划分为石墨烯量子点(GQDs)、石墨氮化量子点(CNQDs)、碳纳米点(CNDs)、碳化聚合物点(CPDs)和CQDs,如图1所示。碳原子的排列、晶体结构、维数等将广泛的碳基荧光纳米点分为3 类:当纳米点呈现非晶态准球形且缺乏量子限制的CNDs;以及当纳米点呈现量子限制和晶体结构时,具有准球形形态的CQDs和具有π共轭单板的GQDs,如图2所示。虽然它们具有相近的尺寸和良好的光化学性质,但内部结构和表面化学基团均有所不同。
CQDs的发光机制复杂且受多种因素影响。目前,有两种发光机制被广泛接受:一种是来自CQDs碳核中共轭π域的带隙状态;另一种是CQDs表面的相关缺陷条带状态。但由于前体碳源的多样性以及在合成过程中掺杂其他元素(氮、硫等以及金属离子),以及局部荧光基团也会影响电子带隙的转变,从而影响荧光颜色。CQDs的发光主要取决于其激发的表面缺陷条带状态,且CQDs表现出两种荧光发射特性。
CQDs因其良好的荧光特性、水溶性、低毒性及表面易修饰等优点,在食品安全检测方法中被广泛用于构建高灵敏、低成本、操作简单的荧光探针。CQDs的荧光传感机制大致可以分为3 类:CQDs表面的羟基、羧基、氨基等活性基团与被检测物质直接作用;通过荧光猝灭开关机制,CQDs与底物或猝灭剂结合导致荧光猝灭,再与被测物质作用恢复荧光;CQDs与抗体、适配体、多肽等特异性配体发生共价偶联,再与被测物质作用。
2 CQDs荧光探针在食品安全检测中的应用
目前,由于分类不清的原因,研究中更多是关于碳点在检测致病菌方面的应用,而关于CQDs在致病菌检测方面较少。Pebdeni等从橄榄叶中合成了高量子产率的CQDs,通过基于荧光共振能量转移(FRET)原理检测金黄色葡萄球菌。特定寡核苷酸适配子共价结合在CQDs表面,CQDs表面的胺基通过静电相互作用吸附到金纳米颗粒(AuNPs)表面合成特定荧光探针。虽然由于寡核苷酸适配子在260 nm波长处具有吸收峰,其结合在CQDs表面会导致荧光强度略微降低,但对实验的影响可以忽略。AuNPs的引入导致FRET过程,在FRET过程中CQDs-适配体的荧光被猝灭,在金黄色葡萄球菌存在下,由于适配体与细菌表面之间的优先相互作用导致CQDs和AuNPs的释放,通过离心使金黄色葡萄球菌-适配体偶联物和AuNPs沉淀,导致上清液中CQD荧光的再现,根据CQDs荧光强度变化得到金黄色葡萄球菌的检测线性范围为10~108 CFU/mL,检测限低至10 CFU/mL。Hu Xuetao等报道了一种以橙皮为碳源通过微波辅助法绿色合成的CQDs,将其用于制备检测大肠杆菌的荧光探针,该探针分别由CQDs与氨基修饰的适配体(Apt)共价偶联,磁性纳米颗粒(MNPs)与氨基修饰的cDNA共价连接,然后由Apt和cDNA杂交组成复合物。利用大肠杆菌与Apt的特异性结合,在检测体系中引入靶标菌和CQDs-MNPs荧光探针复合物,由于大肠杆菌的特异性识别,Apt端优先与大肠杆菌表面结合使Apt-CQDs与cDNAMNPs解离,最后通过磁场分离菌体,检测剩余荧光强度(图3)。CQDs作为荧光探针在检测微生物方面具有良好的灵敏度和实用性,并且操作简单,对操作人员专业性要求不高。上述两种方法均通过CQDs的荧光强度变化进行定量检测,但其基本原理不同,前者是基于FRET原理通过AuNPs猝灭CQDs自身荧光,后者在整个过程中CQDs自身荧光强度变化很小或者无变化,是通过体系中原始荧光探针和剩余荧光探针量的变化产生的荧光强度变化构建检测致病菌的方法。两种方法均很好地证明了CQDs在微生物检测中的巨大优势。
在氨基甲酸酯类农药的检测中,Jing Xu等使用硫化钠和柠檬酸通过水热法合成硫掺杂碳量子点(S-CQDs)作为荧光探针,该探针带有负电荷,且发蓝绿色荧光(图5)。乙酰硫代胆碱(ATC)在乙酰胆碱酯酶(AChE)的催化下水解生成带正电荷的硫代胆碱,由于静电作用导致硫代胆碱聚集在S-CQDs表面,从而导致荧光减弱或猝灭,其原理很可能是基于FRET导致的荧光猝灭或荧光减弱。在该反应体系中,由于抗蚜威的存在抑制了AChE活性,进而抑制了ATC水解成硫代胆碱,导致极少量或者没有硫代胆碱聚集在S-CQDs表面,对S-CQDs的荧光特性影响极小,其荧光强度与抗蚜威标准溶液在0.022~5.000 μg/mL范围内存在线性关系,最低检测限为0.006 μg/mL,该方法在真实样品检测中进行验证,灵敏性高、检测范围广且操作简单。该荧光探针的荧光猝灭依赖于体系中水解产物硫代胆碱,但硫代胆碱的生成受制于AChE,并受温度、pH值的影响。同样地,在有机磷的检测中,Carneiro等设计开发了一种基于CQDs荧光探针的传感方案,利用AgNPs基于FRET可以有效猝灭CQDs荧光的原理,分别测定CQDs、CQDs/农药、CQDs/农药/AgNPs 3 个体系的荧光强度关系,通过线性判别分析得出最大化荧光响应模式的差异,对给定目标分析物作出差异响应,从而提供用于模式识别的指纹图谱进行检测;虽然该方法只能进行半定量,但其较传统方法更为快速、简单、有效,在灵敏度方面还需进一步提高。
环丙沙星(CPX)是一种氟喹诺酮类抗菌药物,其常被用于兽药中。Fan Yao等使用柠檬酸和谷胱甘肽通过水热法在200 ℃反应6 h制备硫氮掺杂碳量子点(S/N-CQDs)作为荧光探针检测四环素类抗生素,其检测原理是探针与四环素类抗生素结合时通过内滤效应(IFE)导致荧光猝灭(图6)。随着四环素类抗生素浓度增加,S/N-CQDs的荧光强度逐渐降低,在10 min内保持稳定,其线性检测范围为1.88~60.00 μmol/L,检出限为0.56 μmol/L,四环素类抗生素在牛奶、蜂蜜、自来水中的回收率高达为93.61%~102.31%,在牛奶和蜂蜜样品的检测中快速、灵敏度高、选择性强。Wei Xiao等开发的基于碲化镉量子点荧光分子印迹传感器检测四环素类抗生素的线性范围为10~160 μmol/L,检出限为0.35 μmol/L。相比于重金属量子点,S/N-CQDs在低浓度下检测四环素类抗生素的结果更为准确,且不受其他抗生素和生物小分子干扰,体现了CQDs优越的荧光性能和稳定性,在毒性方面CQDs比重金属量子点更适用于食品中的检测。
结 语
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