J. Future Foods | 磷酸化卵清蛋白对猪肉肌原纤维蛋白凝胶品质的影响

2023-09-18 21:32:22

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Introduction

猪肉是营养价值最高的动物源性食品之一，其肌肉组织中的纤维柔软、结缔组织较少、肌肉组织中含有更多的肌间脂肪。肌纤维蛋白（MP）是猪肉肌肉中的主要成分，约占蛋白质总量的60%，与肉制品的质地、结构和最终品质密切相关。先前研究表明，猪肉制品具有更强的凝胶形成能力，这主要取决于MP的理化和结构特征。MP在热诱导下形成凝胶，不仅能改善质地和形态，还能提高猪肉的持水性和颗粒黏结能力。因此，MP凝胶的特性对产品质量起着重要的影响作用，并直接影响肉制品的感官品质。

然而，MP在加工、储存和运输过程中容易受到活性氧、过渡金属离子、脂质自由基以及pH、水分活度和温度等环境因素的影响。许多研究已经证实，这些因素可能通过破坏凝胶结构、降低持水能力、降低食用品质（包括味道和颜色）以及持水能力（WHC）来影响MP的凝胶性能。研究发现，天然MP的降解导致蛋白质水合减少，进一步导致巯基、嫩度和凝胶形成能力的丧失。目前改善MP凝胶性能的方法主要有酶法、物理法和化学法。然而酶法改性也存在一些缺点，包括成本高、操作条件困难复杂等。一些物理方法也会对蛋白质特性产生一定的负面影响，例如加热和冷冻。例如，加热过程会损害热敏材料的营养特性。在冷冻过程中，蛋白质的变性和降解容易发生逆转，导致亚基重新结合，从而降低蛋白质的表面活性。其中磷酸化法具有试剂成本低、反应过程简单、环境友好等优点。因此，它被认为是一种高效、绿色的方法，近年来受到越来越多的关注。磷酸化是选择性地将磷酸基团添加到蛋白质侧链活性基团上的过程。这可以通过改变蛋白质分子的电负性来改善蛋白质分子之间的静电斥力，从而提高分离蛋白质的溶解度、凝聚稳定性和凝胶性能。例如，磷酸化MP显著提高了淡软渗出肉和红色硬质正常肉的凝胶强度和食用品质。MP的磷酸化可有效提高其凝胶强度和保水性，且不影响蛋白质的消化率。

越来越多的研究发现，添加外源蛋白质可以成为改善MP特性、提高猪肉产品营养价值的有效策略。鸡蛋中的卵清蛋白（OVA）约占蛋清总蛋白的54%，是一种廉价且易于获取的天然蛋白质。OVA是必需氨基酸和微量元素的重要来源，并且因其较高的肠道吸收率而成为最优质的食物蛋白质之一。此外，OVA由含有385个氨基酸的单肽链组成，其具有六个半胱氨酸残基，在Cys121和Cys74之间形成三个二硫键。在加热条件下，由于二硫键的存在，蛋白质分子迅速聚集。独特的结构使OVA具有出色的凝胶性能。因此，OVA的添加不仅可以促进凝胶网络的形成，而且由于其良好的水溶性，还可以增强凝胶体系的稠度和保水性。由于巯基的存在及其与金属离子的强大螯合能力，OVA被描述为一种强大的抗氧化剂。据报道，添加OVA和β-糊精的混合物，有效促进了MP在冷冻保存过程中形成均匀致密的凝胶网络结构。这也表明OVA和低聚木糖的组合可以显著增强MP的凝胶形成能力。此外，改性OVA可以增强OVA的凝胶特性，扩大其在改善MP凝胶特性方面的应用。目前OVA的修饰主要有热处理修饰、高压处理修饰、超声波处理修饰、磷酸化修饰和酶促修饰等。磷酸化是蛋白质修饰最常见的方法之一。磷酸化不仅可以增加蛋白质的溶解度，还可以提高产品的保水性、乳化稳定性和凝胶强度。先前的研究表明，磷酸化OVA（P-OVA）增加了无规卷曲的含量并改变了其结构。这种效应主要归因于磷酸基团与蛋白质分子之间的相互作用，从而增强了蛋白质结构的灵活性。由于其灵活性，很容易通过共价键与MP分子交联。该过程导致形成致密紧凑的凝胶结构，从而改善凝胶性能。此外，磷酸化蛋白质可以有效吸收外源磷，增加肉制品的营养价值。然而，目前关于P-OVA对凝胶性能影响的研究还很少，其分子水平的解释仍需进一步研究。

本研究旨在研究P-OVA对猪肉MP凝胶特性的影响，并通过评估质构特性和凝胶结构进一步探讨其凝胶机制。评估了凝胶质量特性，例如WHC和凝胶强度。此外，还对凝胶的分子间力、流变特性和微观结构进行了分析。

Results and Discussion

P-OVA添加量对MP凝胶质构特性的影响

TPA测试显示，硬度、内聚性、弹性和咀嚼性等多个参数与MP凝胶的质地和感官特性密切相关。不同P-OVA添加量显著改变了MP凝胶的硬度（P＜0.05）。添加0.5% P-OVA的MP凝胶达到最高硬度1.65 g，比对照组高2.67倍。P-OVA和MP之间的疏水和氢键相互作用是硬度提高的原因。随着OVA添加量的增加（1.0%），硬度显著增加，但随着P-OVA的添加量为1.0%，硬度下降（P＜0.05）（图1A）。凝胶硬度下降的原因是过量的P-OVA减弱了MP与P-OVA之间的相互作用并导致解聚。P-OVA显著提高了MP凝胶的内聚性和弹性（P＜0.05），添加0.5% P-OVA时内聚性最高为0.42，弹性为2.7 mm。然而，经1.0% P-OVA处理的样品表现出比0.5% P-OVA-MP凝胶更低的内聚性和弹性（P＜0.05），而1.0% OVA和1.0% P-OVA组之间没有显著差异（P＞0.05）（图1B和1C）。这一结果是由于P-OVA和MP之间的氢键和疏水相互作用促进了凝胶的形成。在凝胶化过程中，更多的疏水基团暴露出来并与P-OVA相互作用，从而通过增加弹性来提高凝胶的稳定性。咀嚼度与硬度的变化相似，添加0.5% P-OVA 时咀嚼度达到最高（2.53）。随着P-OVA量的增加（1.0%），咀嚼性降低，但仍高于对照组MP凝胶（图1D）。类似的结果此前已有报道。研究人员发现，在冷冻保存过程中添加OVA和β-环糊精混合物后，MP凝胶的硬度、内聚力和弹性显著增强。这表明P-OVA促进了蛋白质中二硫键和交联的发展，从而增强了凝胶的特性。总体而言，质构分析表明含有0.5% P-OVA的MP凝胶显示出最佳的质构特性值。

图1 不同浓度的P-OVA对MP凝胶结构的影响

P-OVA对MP凝胶WHC和凝胶强度的影响

WHC定量地表示蛋白质凝胶网络结构内保留的水量，可以反映蛋白质凝胶的结构。凝胶强度是代表凝胶结构强度的指标。这两项指标都与肉制品的品质密切相关。图2A显示，随着P-OVA添加量的增加，MP凝胶的WHC显著增强（P＜0.05）。添加1.0% P-OVA处理的MP凝胶的WHC高于70%，其中添加1.0% P-OVA处理的MP凝胶的WHC最高（75.89%），是对照MP凝胶（66.14）的1.15倍。这表明随着P-OVA添加量的增加，保水性显著提高，并且加热过程中失水量减少。这反映出P-OVA的添加提高了蛋白质浓度并提高了蛋白质保留水分的能力，从而导致MP凝胶的WHC增加。作为凝胶粘合剂之一，P-OVA促进蛋白质之间的分子间相互作用并与MP交联，从而形成有序且均匀的结构。P-OVA和MP之间相互作用的增强促进了更致密的网络结构的构建，从而有利于水分子的捕获并增加了MP凝胶的WHC。此外，研究表明，磷酸化修饰可以使亲水性磷酸基团与蛋白质侧链交联，导致蛋白质亲水性和溶解性增加，从而提高可溶性蛋白质的浓度。因此，添加P-OVA可以通过增加可溶性蛋白浓度来提高MP凝胶的WHC。

图2 P-OVA在不同浓度下对MP凝胶的凝胶特性的影响

图2B显示添加P-OVA后各组的凝胶强度均显著高于对照组（P＜0.05）。添加0.5% P-OVA后观察到最大凝胶强度（168.56 g·mm）。然而，随着P-OVA添加量的增加（1.0%），凝胶强度似乎有所下降。结果表明，0.5% P-OVA能有效增强凝胶的凝聚，促进MP凝胶强度的增加。先前的研究报告称，OVA可以作为粘合剂，通过增强与MP的胶凝和持水特性相关的分子间相互作用力来促进MP的凝胶形成。此外，热处理后蛋白质固化导致蛋白质分子彼此紧密交联，从而增加了MP的WHC和凝胶形成能力。

P-OVA对MP凝胶Zeta电位和疏水性的影响

凝胶的形成是通过分子间相互作用之间的力平衡维持的。MP热凝胶过程中，主要作用力包括二硫键、疏水作用力、静电力和氢键。如图3A所示，添加0.5% P-OVA后，Zeta电位的绝对值急剧上升，但随着P-OVA添加量的增加（1.0%），Zeta电位的绝对值显著下降。0.5% P-OVA样品的表面疏水性增加最高（15.2 μg），而添加1.0% P-OVA后疏水性比对照MP凝胶急剧下降（P＜0.05）（图3B）。0.5% P-OVA后Zeta电位较高，归因于表面负电荷增加和静电斥力增强。据报道，具有高净电荷（负或正）的凝胶系统是电稳定的，而具有低Zeta电位的凝胶系统则倾向于絮凝。因此，添加0.5% P-OVA增加了凝胶的表面电荷，从而通过增加分子间静电斥力抑制分子聚集。结果表明，0.5% P-OVA的添加提高了凝胶体系的稳定性。添加1.0% P-OVA后Zeta电位的绝对值较低，表明分子间排斥力的降低导致加热过程中疏水部分更多地暴露于表面。表面电荷的减少导致静电相互作用增加，表现为静电引力促进界面上蛋白质的吸附，从而导致三维凝胶网络结构更强，但凝胶体系不稳定。据观察，表面疏水性的增加可能与暴露的疏水分子之间形成疏水相互作用有关，从而导致蛋白质变性和聚集增强。冷冻储存期间表面疏水性的增加也可能与疏水聚集体的产生有关。添加1.0% P-OVA后MP凝胶的疏水性较低，可防止MP蛋白变性。因此，P-OVA可以改变分子间相互作用，从而形成并维持凝胶网络结构，进一步改善MP的凝胶性能。

图3 不同浓度的P-OVA对MP凝胶（A）Zeta电位和（B）疏水性的影响

P-OVA添加对MP凝胶流变性质的影响

凝胶通常根据其流变性质进行评估，通常使用G'和G"来评估。这些参数分别可以深入了解材料的弹性和黏性变形。如图4所示，在添加1.0% P-OVA后，G'和G"的值最高，而在添加0.5% P-OVA后最小。在20～50 ℃之间，G'和G"的变化很小，表明在这个温度范围内蛋白质相互作用较弱，不足以形成预凝胶。0.5% P-OVA添加后，从35～50 ℃，G'和G"的值呈下降趋势，可能是由于肌球蛋白的降解和相互作用力减弱所导致。先前的研究表明，热诱导的凝胶形成能力主要源自肌球蛋白。因此，肌球蛋白的降解导致了凝胶网络结构暂时变质。当温度升至50 ℃时，G'和G"均呈上升趋势，表明凝胶网络结构得到了增强。与先前的研究一致，添加1.0%和0.5% P-OVA后MP的变化趋势可分为三个温度范围：固化、减弱和增强。与对照组相比，1.0% P-OVA添加组的G'和G"略有上升，表明蛋白质凝胶的交联程度增强，MP的凝胶性能得到了改善。

图4 不同浓度的P-OVA对MP凝胶流变性能的影响

P-OVA对MP凝胶紫外光谱的影响

蛋白质结构和氨基酸环境修饰可以通过紫外吸收光谱的变化来检测。如图5A所示，在1.0％P-OVA-MP组中观察到最高吸光度值。在二阶导数光谱中，有两个峰和谷，分别位于紫外光谱中的285、294 nm（峰值）和283、292 nm（谷值）（图5B）。285 nm处的峰归因于酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）的协同作用，而294 nm处的峰则归属于Trp。在添加P-OVA后，Trp的峰值明显向蓝移，与对照组相比，表明了更强的溶剂环境极性。还通过二阶导数吸收峰中的两个峰和谷的比率（r＝a/b，其中a代表峰值（285 nm）到谷值（282 nm）的距离值，b代表从峰值（295 nm）到谷值（292 nm）的距离值来研究Tyr残基周围的微环境变化）。添加0.5%P-OVA后r值增加，添加1.0%P-OVA后r值下降。添加0.5% P-OVA后r值增加是由于微环境极性的增加。热处理后，更多的内部酪氨酸残基暴露在更多的极性环境中，导致疏水相互作用力增加，导致蛋白质聚集并强化凝胶网络结构。先前的研究还利用紫外二阶导数光谱研究了MP的结构变化。结果表明，改性MP表现出改善的凝胶特性，r值增加表明Tyr残基暴露于极性溶剂中。添加1% P-OVA后，环境的极性减小，蛋白质降解减弱了凝胶结构。与对照组相比，多次冻融循环对猪长肌肉中蛋白质结构的影响也有类似的发现，并发现r值的增加促进了疏水基团的更快暴露。添加1% P-OVA后，环境极性降低，蛋白质降解削弱了凝胶结构。

图5 不同浓度的P-OVA对MP凝胶紫外光谱的影响

P-OVA添加对MP凝胶FTIR和二级结构的影响

如图6A所示，添加0.5％ OVA和对照组之间未观察到峰强度的显著差异。添加0.5% P-OVA后，观察到1500～2000 cm^－¹处的峰强度降低。添加1.0% P-OVA后，1500～2000 cm^－¹处分子内氢键C＝C伸缩振动峰强度增大，而3000～3500 cm^－¹处峰带变窄。蛋白质二级结构的变化如图6B所示。添加P-OVA后，α-螺旋含量下降，添加0.5% P-OVA时α-螺旋含量最低。然而，添加P-OVA后，β-折叠和无规卷曲的含量增加，且添加0.5%后β-折叠含量最高（40.43%）。先前的研究表明，蛋白质二级结构中的α-螺旋比β-折叠结构更加刚性。从α螺旋到β-折叠的转变表明分子的无序性和灵活性增加。在这项研究中，发现添加P-OVA可以增强MP凝胶中分子的柔韧性，通过相互作用力促进颗粒之间的连接。加热过程中的这些分子结构变化可能会增加凝胶网络形成的可能性，最终改善凝胶性能。研究人员研究了热诱导凝胶化过程中兔肌球蛋白结构和功能特性的变化及其关系，发现凝胶形成过程中α-螺旋含量减少。这表明α-螺旋对凝胶形成有不利影响。另据报道，鱼和猪肉蛋白热凝胶时β-折叠的增加促进了凝胶的形成，有利于形成更稳定的凝胶结构。因此，添加P-OVA后较低的α-螺旋含量和较高的β-折叠含量可能导致更有利的凝胶结构。

图6 不同浓度的P-OVA对MP凝胶二级结构的影响

P-OVA对MP凝胶扫描电镜的影响及相关性分析

MP凝胶的显微结构如图7A所示。MP凝胶表面呈网状结构，对照组的孔洞结构较多，说明蛋白质聚集程度较低。加入P-OVA后，孔隙率降低，凝胶网络变得更加紧密。因此，由于P-OVA削弱了静电连接并导致蛋白质聚集，混合凝胶变得更加紧密。此外，柔性P-OVA很容易与MP形成交联。随后，P-OVA在加热过程中逐渐脱水凝结，形成有序、均匀的网络结构。与纯MP凝胶相比，添加1.0%的OVA和P-OVA会使蛋白质团聚的外观更致密。先前的研究也证实，蛋清蛋白能与MP发生强烈的相互作用，进而促进蛋白质的聚集并增强凝胶的网络结构。因此，添加P-OVA有助于在MP凝胶中形成有序和致密的结构，从而保留更多的水分并提高凝胶强度。

图7 （A）不同浓度的P-OVA对MP凝胶微观结构的影响；（B）凝胶性质、分子间相互作用力和结构之间的相关性

相关性分析

通过相关分析检测了凝胶特性、分子间相互作用力和结构之间的相关性（图7B）。硬度与回弹性（0.9）和内聚性（0.9）呈正相关。凝胶强度与回弹性（0.8）和疏水性（0.7）呈正相关。这表明硬度高、凝胶强度大的凝胶能增强其抵抗外应力的能力，从而改善质地特性。α-螺旋含量与凝胶强度及其质构特性呈显著负相关（P＜0.05）。此外，β-螺旋与硬度、咀嚼性和凝胶强度呈负相关。这是因为蛋白质二级结构中含有大量稳定的α-螺旋和β-螺旋，从而稳定了分子结构，在加热过程中分子不易连接。因此，质地特性和凝胶硬度都有所下降。β-折叠与WHC的相关系数为0.7（P＜0.05）。对于较高的β-折叠，柔性的二级结构有助于增加蛋白质分子的交联可能性，并增强凝胶强度。

Conclusion

本研究探讨了不同浓度（0.5%和1.0%）的P-OVA对MP凝胶特性的影响。结果表明，添加P-OVA后，MP凝胶的硬度、内聚性、弹性等质构特性显著改善。添加0.5% P-OVA后，凝胶性能得到了最佳改善，WHC也随之增加（达到75.89%）。凝胶性能的改善表现在更高的zeta电位和暴露的疏水相互作用。此外，从分子水平上看，P-OVA可以改变MP凝胶的流变特性，通过减少α-螺旋和增加β-折叠，形成更致密和均匀的凝胶网络结构。本研究表明P-OVA可以有效改善MP的凝胶特性，这对于肉制品特性的改善具有重要意义。

第一作者

于智慧博士，山西农业大学副教授。研究方向为农产品精深加工及脂质营养。主持省基金项目2项，发表SCI论文11篇。

通信作者

陈益胜教授，德国理学博士-博士后，山西农业大学（山西省农科院）高层次引进人才，山西农业大学食品科学与工程学院食品营养与检测技术研究中心（筹）负责人。2017年在德国柏林获“Dieter Jänchen Award of the Young Researcher”。多次应邀在法国里昂、德国柏林、泰国曼谷、四川成都、海南三亚等地举行的国际学术会议上做口头报告。

Effects of phosphorylated ovalbumin on the quality of pork myofibrillar protein gel: an insight into gelling and physicochemical properties

Zhihui Yu^a,1, Yating Gao^a,1, Meng Wu^a, Chaofan Zhao^a, Xiubin Liu^b, Xiaoyu Zhang^a, Lixin Zhang^a, Yisheng Chen^a,c,*

^a College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China

^b College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

^c Houji Laboratory in Shanxi Province, Shanxi Agricultural University, Taiyuan 030031, China

¹ These authors contributed to the work equally and should be regarded as co-first authors.

*Corresponding author.

Abstract

This study aimed to investigate the effects of phosphorylated-ovalbumin (P-OVA) at different concentrations (0.5% and 1.0%) on the gel properties of pork myofibrillar protein (MP). The results showed that the textural properties such as gel hardness, cohesiveness, springiness and chewiness were improved with P-OVA addition at 0.5%. The water holding capacity (up to 75.89%) and gel strength (up to 168.56 g·mm) of MP gel were markedly increased after P-OVA addition. The absolute value of zeta potential reached 13.85 mV and maximum hydrophobicity (15.2 μg) resulted from the addition of 0.5% P-OVA. The storage modulus (G’) and loss modulus (G’’) of MP gel were significantly increased from 50°C, and the G’ and G’’ significantly increased after 1.0% P-OVA addition, evidencing that the cross-linking effect of MP protein gel was enhanced. In addition, the P-OVA addition improved the structure of MP gel protein by reducing the α-helix, while increasing the β-sheet and the r-value (the ratio between two ultraviolet second-derivative peak-to-trough distances), which further promoted the uniform and compact gel network structure. This work demonstrated that P-OVA is a highly effective modifier that significantly improves the quality of MP gel. From a view of practice, 0.5% P-OVA is the optimal addition amount.

Reference:

YU Z H, GAO Y T, WU M, et al. Effects of phosphorylated ovalbumin on the quality of pork myofibrillar protein gel: an insight into gelling and physicochemical properties[J]. Journal of Future Foods, 2024, 4(2): 149-158. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.06.006.

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