褐藻是一种广泛分布在海洋生态系统中的大型藻类。藻胶是褐藻细胞壁中一种主要的线性多糖，占褐藻干质量的40%。研究发现，褐藻胶降解成褐藻胶寡糖后，生物利用性和生物活性显著提高。利用酶法制备褐藻胶寡糖具有反应特异性高、反应条件温和、降低环境污染等优点，在褐藻胶寡糖的制备中更具有优势。非催化结构域可能影响褐藻胶裂解酶的催化性质。褐藻胶裂解酶常见的非催化结构域包括碳水化合物结合模块（CBM）和F5/8 C型结构域。大多数褐藻酸裂解酶的活性和稳定性较低，限制了该酶的广泛应用。褐藻胶裂解酶非催化结构域的截短或重组可能改良酶催化性质。

集美大学海洋食品与生物工程学院的黄小艺、朱艳冰*和厦门医学院药学系的李鹤宾等研究组前期从腐烂的海带中分离得到海洋微泡菌ALW1，基因组分析发现含有1 个预测为PL7家族的褐藻胶裂解酶AlgL7的编码基因，该酶包含2 个非催化模块CBM和F5/8 C型结构域。为了解该酶非催化结构域的功能，通过基因截短、蛋白质表达和纯化，研究非催化模块对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响，旨在解析该酶非催化结构域与酶性质的构效关系，为酶的实践应用提供一定理论基础。

01 褐藻胶裂解酶Alg7的序列分析

微泡菌ALW1的褐藻胶裂解酶AlgL7基因（GenBank收录号OM831233）有1 893 个碱基对，预测编码630 个氨基酸残基的蛋白质，理论等电点（pI）为4.40，理论分子质量为71.5 kDa。如图1a所示，系统发育分析显示，AlgL7与来自PL7家族的褐藻胶裂解酶处于同一分支，表明该褐藻胶裂解酶属于PL7家族。如图1b所示，保守结构域分析显示，AlgL7含有CBM结构域（Ile⁵⁵～Tyr¹⁵⁸）、F5/8 C型结构域（Ala²⁰²～Val³²²）和C端催化结构域（Phe³⁶⁴～His⁶³⁰）。C端催化结构域命名为CD1，包含F5/8 C型结构域和C端催化结构域的截短酶命名为CD2。此外，序列比对确定了微泡菌ALW1来源的AlgL7中含有QIH（Gln⁴⁹⁷～His⁴⁹⁹）、RTELREMLR（Arg⁴²⁸～Arg⁴³⁶）和YFKAG（Tyr⁶⁰⁰～Gly⁶⁰⁴）3 个保守区域，推测它们与促进底物识别和酶功能有关。

02 褐藻胶裂解酶Alg7及其截短体的表达与纯化

成功构建了AlgL7、截短体CD1和CD2的基因工程菌株，利用IPTG进行诱导表达后，进行重组蛋白的纯化，SDS-PAGE分析显示，目的蛋白成功纯化，AlgL7、CD1和CD2的分子质量分别约为71.5、32.0 kDa和60.0 kDa（图2a），与蛋白质的理论分子质量吻合。酶活力分析结果表明，以海藻酸钠为底物，AlgL7、CD1和CD2的比活力分别为125.1、125.9 U/mg和183.9 U/mg（图2b）。AlgL7和CD2的酶活力相比，CBM结构域截短会显著增强酶的催化活性，CD2是AlgL7全长酶活力的1.47 倍，来自Vibrio natriegens SK42.001褐藻胶裂解酶Aly01FL的CBM截短体也显示出类似酶活力增强的现象，来自Marinimicrobium sp. H1褐藻胶裂解酶AlgH-I的CBM截短体显示出酶活力降低的影响结果。CD1和CD2酶活力相比，F5/8 C型结构域截短会降低酶的催化活性，Flammeovirga sp. MY04来源褐藻胶裂解酶Aly5的F5/8 C截短体对海藻酸钠的酶活力也低于野生型酶，说明F5/8 C型结构域在维持酶活力方面具有重要作用。

03 褐藻胶裂解酶Alg7及其截短体的底物特异性

如图3所示，AlgL7、CD1和CD2对海藻酸钠、polyM和polyG 3 种底物均有活性，说明非催化结构域CBM和F5/8 C型结构域未影响酶的底物特异性，它们对底物的催化活性不是必需。另外，与AlgL7相比，CD2对ployG的酶活力显著提高，CD1和CD2对polyM的酶活力显著降低，CD2对海藻酸钠的酶活力显著，说明非催化结构域CBM和F5/8 C型结构域影响了酶对不同底物的催化活性。

本研究中，去除CBM结构域的CD1和CD2截短酶对polyM酶活力显著降低（图3），说明非催化结构域CBM可能影响了AlgL7对PolyM底物的结合与识别。褐藻胶裂解酶AlgL7包含QIH保守结构域，是一个对polyM和polyG都起作用的双功能褐藻胶裂解酶。PL7家族的褐藻胶裂解酶包含3 个高度保守的区域（R/E）（S/T/N）EL、Q（I/V）H和YFKAG（V/I）YNQ，这些保守区域形成了β-三明治形状的空腔结合底物。本研究中，褐藻胶裂解酶AlgL7包含QIH保守结构域，是一个对polyM和polyG都起作用的双功能褐藻胶裂解酶。

F5/8 C型结构域被称为discoidin（DS）结构域，它可以通过增强酶与底物的相互作用能提高糖苷水解酶的水解活性。本研究中，与CD2相比，去除F5/8 C型结构域的CD1截短酶对PolyG和海藻酸钠的酶活力显著降低（图3），说明F5/8 C型结构域可能影响了AlgL7对PolyG底物的相互作用。

04 温度对Alg7及其截短体活性和稳定性的影响

如图4a所示，AlgL7和CD2在40 ℃时催化活性最高，CD1的最适反应温度为30 ℃，说明CBM对酶的最适反应温度无影响，F5/8 C型结构域去除降低了酶的最适反应温度。大部分PL7家族褐藻胶裂解酶的最适反应温度为30～45 ℃。移除CBM结构域并不改变褐藻胶裂解酶Aly01的最适反应温度。而褐藻胶裂解酶AlyL2中，截短CBM13结构域，酶的最适反应温度降低了10 ℃。F5/8 C型结构域在酶的生化特性中与酶最适反应温度紧密相关。

如图4b所示，相较于AlgL7，截短酶CD2的热稳定性显著增强，在20～35 ℃下孵育15 min，残余酶活力保持在45%以上，表明非催化结构域CBM的截短提高了酶的热稳定性。截短褐藻胶裂解酶的非催化结构域后，该酶可能具有紧凑的三维结构，更有利于抵抗热变性条件。与本研究结果不同，褐藻胶裂解酶AlyL2的CBM提高了酶热稳定性。另外，在20～35 ℃范围内，截短酶CD1的温度稳定性低于截短酶CD2，说明F5/8 C型结构域的去除降低了酶的温度稳定性。

05 pH值对Alg7及其截短体活性和稳定性的影响

如图5a所示，AlgL7及其截短体的最适反应pH值均为7.0，说明CBM和F5/8 C型结构域对酶的最适反应pH值无影响。褐藻胶裂解酶AlgH结构中F5/8 C型结构域也不改变酶的最适反应pH值。如图5b所示，截短体CD2在pH 3.0～6.0和8.0～11.0范围内的pH值稳定性高于AlgL7，表明CBM的去除提高了酶在酸性和碱性条件下稳定性。对褐藻胶裂解酶AlyL2-FL去除C端的CBM结构域，最适反应pH值由8.6降低至7.0，在pH 3.0～6.0范围内去除CBM的截短体保留酶活力远低于原始型酶。对褐藻胶裂解酶VxAly7B去除N端的CBM结构域，酶的最适反应pH值提高了0.6，在pH 3.0～6.0范围内残余酶活力略高于原始型酶。另外，本研究中图5b所示截短酶CD2相较于CD1在pH 3.0～6.0和10.0～11.0范围内pH值稳定性高于CD1，表明F5/8 C型结构域提高了酶在酸性和碱性条件下的稳定性。

06 褐藻胶裂解酶Alg7及其截短体的动力学参数

如表2所示，以海藻酸钠为底物，AlgL7的Km和Vmax值最低，CD2的Km和Vmax值最高，表明CBM结构域降低了酶的最大反应速率，但提高了酶与底物之间的亲和力，促进AlgL7与海藻酸钠的结合；F5/8 C型结构域提高了酶的最大反应速率，但降低了酶与底物之间的亲和力。然而，在不同褐藻胶裂解酶中，CBM表现出不同的影响。

07 褐藻胶裂解酶Alg7及其截短体的酶解产物分析

如图6所示，AlgL7能够将海藻酸钠降解生成聚合度为2、3和4的寡糖，降解polyG和polyM的主要产物为二糖和三糖（图6a～c），表明AlgL7是一种内切型褐藻胶裂解酶。CD1和CD2降解海藻酸钠、polyM和polyG的产物均为二糖和三糖（图6d～i）。上述结果表明，CBM和F5/8 C型结构域对酶解产物没有显著差异，表明非催化结构域在底物降解模式中没有发挥重要作用。

结论

克隆表达了微泡菌ALW1来源的褐藻胶裂解酶全长酶AlgL7及其两个截短酶CD1（催化结构域）、CD2（包含F5/8 C型结构域和催化结构域）。酶学性质的比较分析显示，CBM结构域降低了酶的催化活性、热稳定性和Vmax值，但提高了酶与底物的亲和力；F5/8 C型结构域提高了酶的催化活性、最适反应温度、热稳定性和Vmax值，但降低了酶与底物的亲和力。截短体CD2的酶活力和热稳定性得到显著提高，能降解海藻酸钠生成聚合度低的褐藻胶寡糖二糖、三糖和四糖。本研究明确了非催化模块CBM和F5/8 C型结构域对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响，获得了具有优良性质的截短酶CD2，扩大该褐藻胶裂解酶的应用范围。

本文《N端非催化结构域对微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第16期169-176页，作者：黄小艺, 李鹤宾, 陈艳红, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220815-159。