负载花旗松素玉米醇溶蛋白纳米载体的制备及在大鼠体内促吸收作用

2023-12-11 23:56:15

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Introduction

花旗松素是一种常见于多种植物和水果中的黄酮化合物，如洋葱、牛奶蓟、橙子、葡萄和葡萄柚等。研究表明，花旗松素具有抗氧化、保肝、抗癌等多种显著的生物活性，是许多保健品的功能成分，如水飞蓟素（Legalon™）、碧萝芷醇（Pycnogenol®）和Venoruton®。通常，黄酮类化合物由于难溶、不稳定且渗透性差，在体内很难被吸收。花旗松素在Caco-2细胞中的表观渗透系数＜1×10⁻⁶ cm/s，在大鼠体内的绝对生物利用度仅为0.17%～0.49%。因此，要最大程度发挥花旗松素的健康促进作用，一个关键问题是如何促进其体内吸收。

玉米醇溶蛋白（Zein）是玉米胚乳中的主要存储蛋白。Zein中含有超过50%的非极性氨基酸，因此不溶于水，而易溶于60%～95%的乙醇。在降低乙醇浓度的过程中，Zein会逐渐失去溶解性，其特殊的双亲结构可诱导发生自组装，从而自发形成微米或纳米级颗粒、纤维和膜。Zein独特的自组装特性使其成为一种很有前景的食品功能成分载体。

江西农业大学李莹硕士，张清峰副教授等以Zein为载体，酪蛋白酸钠为稳定剂，采用反溶剂法制备了负载花旗松素的Zein纳米颗粒（TZP）。对TZP进行不同手段表征、并测定了花旗松素在TZP中的稳定性和扩散性能。最后，通过利用UPLC-QTOF-MS和UPLC-QqQ-MS/MS研究TZP在大鼠体内对花旗松素促吸收作用。

Results and Discussion

TZP的理化表征

Zein对花旗松素具有很好的负载效果，优化条件下制备得到的TZP的粒径为168.74 nm，ζ电位为-57.67 mV，花旗松素的包封率为85.83%，固载率为17.11%。通过XRD、DSC和FTIR等手段对冻干TZP的表征结果表明花旗松素失去了晶体结构、以无定型状态存在于蛋白载体中，并与蛋白质存在次级键的相互作用。冻干TZP具有极好的水复溶性，加水后可立刻重新分散形成纳米粒子，粒径几乎无变化（图1）。

图1 TZP的粒径（A）、冷冻干燥（B）及加水复溶后（C）扫描电镜照片

TZP中花旗松素的体外扩散及稳定性

大多数植物化学物质在小肠上皮细胞中缺乏特异性的受体，因此在体内吸收主要是通过被动扩散。而被动扩散速度与溶解度呈正相关。在25℃条件下，花旗松素在水中的溶解度仅为350 μg/mL，属于极难溶化合物。然而，当负载于TZP时，花旗松素可以很好地以纳米颗粒的形式分散在水中，从而改善其被动扩散速度。如图2A所示，在模拟肠胃液中，花旗松素在TZP中的扩散速度远快于其混悬液。体外半透膜扩散结果表明，TZP可以提高花旗松素跨膜浓度梯度，增加扩散速度，可能有助于提高其体内生物利用度。

黄酮类化合物在胃肠道中的降解也可能限制其在体内的吸收，而被负载于zein内部可以提高其稳定性。如图2B所示，花旗松素在模拟胃肠液中很稳定，在SIF和SGF孵育4小时几乎没有发生分解。因此，TZP的增稳作用没有得到体现。

图2 TZP中花旗松素的体外扩散（A）及稳定性（B）

TZP对花旗松素在大鼠体内的促吸收在作用

黄酮苷元经口服吸收后，通常首先在肠细胞和肝细胞中发生I相和II期代谢(如硫酸化、葡萄糖醛酸苷和/或甲基化)，然后进入血液循环系统。在本研究中，大鼠口服TZP后，利用UPLC-QTOF-MS在大鼠血浆中鉴定发现了花旗松素及其5种主要代谢物，分别为Tax-CH3、Tax-CH3-sul、Tax-CH3- glu、Tax-Glu和Tax-Slu。应用UPLC-QqQ-MS/MS对花旗松素及其5种代谢物进行定量（图3）。在第1小时内，TZP组花旗松素及其代谢物浓度显著高于花旗松素悬液组。同时，Tax-Glu和Tax-CH3-Glu的血浆浓度明显高于花旗松素，表明葡糖醛酸化是花旗松素在体内的主要代谢途径。

采用DAS 2.0软件计算口服花旗松素的药代动力学参数，如表1所示，C_max从0.11 μg/mL提高到0.43 μg/mL，半衰期（t_1/2）从4.11 h延长到5.56 h，花旗松素的绝对生物利用度从0.35%提高到0.52%，提高了1.48倍。以上结果表明TZP促进了大鼠对花旗松素的吸收，这可能是由于TZP增强了花旗松素在肠胃中的扩散速度和粘附作用。

表1 大鼠静脉注射花旗松素（iv 2 mg/kg）和口服TZP（20 mg/kg）药代动力学参数

图3 大鼠口服TZP（20 mg/kg）后血浆中花旗松素及其代谢物的MRM色谱图（A）及浓度-时间曲线：花旗松素（B）、Tax-CH3（C）、Tax-CH3-Glu（D）、Tax-Glu（E）、Tax-Sul（F）

Conclusion

采用反溶剂法制备了负载花旗松素的Zein纳米颗粒(TZP)。TZP对花旗松素具有很好的负载效果，包封率为85.83%，固载率为17.11%。冻干TZP具有极好的水复溶性，花旗松素以无定型状态存在于蛋白载体中。TZP可以显著提高花旗松素的跨膜扩散速度。大鼠口服TZP后，用UPLC-QqQ-MS/MS定量了血浆中花旗松素及其5种代谢产物。TZP使花旗松素的生物利用度从0.35%提高到0.52%，提高了1.48倍。同时发现葡糖醛酸化代谢产物浓度显著高于花旗松素本体，说明葡糖醛酸化是花旗松素在体内的主要代谢途径。

第一作者

李莹，女，硕士。于2022年获江西农业大学食品科学硕士学位，现西北农林科技大学食品工程博士在读。主要从事天然产物的开发与利用相关研究，以第一作者身份在Biomedicine & Pharmacotherapy、Food Science and Human Wellness、Food & Function、Food Science and Technology等杂志发表SCI论文4 篇。

通信作者

张清峰，男，1983年生，江西农业大学副教授，硕士研究生导师。2010年博士毕业于香港城市大学，获周亦卿奖学金及两次研究生杰出学术表现奖。2010年7月进入江西农业大学食品学院工作，主要从事食品化学、食品生物化学、天然产物与功能食品等方面的教学和研究。以第一或通讯作者发表学术论文50余篇，其中SCI收录40余篇、已被SCI引用千余次、H指数为21。主持国家自然科学基金两项，江西省自然科学基金、江西省教育厅科学基金、江西农业大学自然科学基金等项目六项；参与十余项；申请专利十项，已获得授权专利六项，转让企业生产技术两项，并为多个企业提供技术服务。获得江西省自然科学三等奖一项，抚州市科技进步二等奖一项。Food Chemistry，Carbohydrate Polymers，Analytica Chimica Acta，《食品与发酵工业》，《现代食品科技》等二十余本学术刊物审稿专家。

Fabrication of taxifolin loaded zein-caseinate nanoparticles and its bioavailability in rat

Ying Li^a, Hang Su^a, Wenjun Wang^a, Zhongping Yin^a, Jing’en Li^a, En Yuan^b, Qingfeng Zhang^a,*

^a Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food, College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China

^b College of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, China

*Corresponding author.

Abstract

Taxifolin loaded zein-caseinate nanoparticles (TZP) were fabricated by the anti-solvent method and were used as an oral delivery vehicle to improve their bioavailability in the rat. The formulations of TZP were optimized. With mass ratio of 1:1:2 between taxifolin, zein and sodium caseinate, the particle size and ζ-potential of TZP were (168.74 ± 0.35) nm and (−57.67 ± 0.25) mV, while the encapsulation and loading efficiency of taxifolin were (85.83 ± 0.89)% and (17.11 ± 0.88)%, respectively. After freeze-drying, TZP exhibited excellent redispersibility in water without aggregation. Physicochemical characterization showed that taxifolin existed in amorphous form in TZP and its interaction with the protein was observed. After encapsulating in TZP, the excellent dispersion of taxifolin in water significantly improve its diffusion velocity through a semi-permeable membrane. After oral administration, taxifolin and its five metabolites were identified in rat plasma by ultra high performance liquid chromatography (UPLC) with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS). The dynamic variation of taxifolin and its metabolites in plasma were then quantified by UPLC with a triple-quadrupole typemass spectroscopy (UPLC-QqQ-MS/MS). A pharmacokinetic study showed that the bioavailability of taxifolin increased from 0.35% to 0.52% through TZP fabrication. The plasma concentration of taxifolin glucuronide and methylated taxifolin glucuronide was much higher than taxifolin. Glucuronidation was the dominating metabolism pathway of taxifolin in vivo.

Reference:

LI Y, SU H, WANG W J, et al. Fabrication of taxifolin loaded zein-caseinate nanoparticles and its bioavailability in rat[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2306-2313. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.034.

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