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中国农业大学张拓副教授等:铁蛋白纳米载体在营养与健康领域的应用研究进展
2022-11-04 15:52:49 食品科学杂志 1350
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铁蛋白是广泛存在于生物体中的一种铁储藏蛋白,其主要生物学功能有两种:一是将二价铁离子转化成可溶无毒且生物可利用的三价铁形式并储存于蛋白质内部空腔,调节铁代谢平衡;二是清除亚铁离子介导的自由基反应,保护细胞免受氧化性损伤。天然的铁蛋白由蛋白质外壳和内部铁核两部分组成,外壳是由24 个相同或不同的亚基构成的具有高度对称结构的中空笼状蛋白质分子,铁核则是由大量氢氧化铁和磷酸盐组成。在无氧条件下可利用还原反应将铁核去除,从而制备得到具有内部空腔的脱铁铁蛋白外壳。铁蛋白的笼状外壳非常稳定,具有较强的酸碱耐受性(pH 2.0~12.0)以及热稳定性(蛋白质变性温度为70~80 ℃)。铁蛋白的高级结构主要是由亚基间的氢键和疏水作用维持,故可以通过物理化学的手段将其亚基解离及重新组装,其可逆的解离重组特性为铁蛋白纳米笼作为包埋外壳以及递送载体的应用奠定了基础。


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目前为止,铁蛋白已被广泛用于包埋花青素、姜黄素、芦丁等多种食品营养素以提高其水溶性、稳定性以及细胞吸收率,利用铁蛋白装载抗癌药物、造影剂等成分可用于实现药物的靶向传递、细胞成像以及肿瘤治疗等研究。此外,由于天然蛋白质结构单一,铁蛋白也被科学家们广泛用于人工设计制造不同结构性质的新型笼形蛋白,这极大拓展了铁蛋白作为纳米载体的应用范围。中国农业大学食品科学与营养工程学院的刘 博、张晨曦、张 拓*等对铁蛋白分子的结构特点进行系统总结,并重点介绍其作为纳米载体应用于食品科学、营养健康及医药成像等领域的研究进展。


1、铁蛋白的结构

铁蛋白的典型结构特征

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亚基结构由1 个两两成反向平行的α螺旋簇(A、B和C、D螺旋)和1 个较短α螺旋(E螺旋)组成,B和C螺旋之间由一段被称为BC-环的氨基酸链连接,E螺旋位于α螺旋簇的尾端并与之成60°夹角(图1A)。铁蛋白亚基的氨基端、BC-环、A螺旋和C螺旋构成铁蛋白的外表面,B螺旋和D螺旋则位于内表面。铁蛋白内表面富含谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸残基,因此在pH值为中性的条件下,铁蛋白内表面具有较高的负电荷密度,而外表面的净电荷接近于零或略带正电荷。
铁蛋白分子具有3 种化学性质不同的活性界面:内表面、外表面、亚基间界面(图1B),而这3 种界面均可通过化学和基因手段进行修饰来实现铁蛋白的功能调控。化学修饰指将染料分子、猝灭剂等功能性小分子与铁蛋白特定氨基酸进行化学偶联,基因修饰是定点突变、添加或删除特定氨基酸改变铁蛋白的基因序列。铁蛋白外表面偶联修饰一些官能团可赋予其发光成像等特性,内表面主要是作为纳米反应器合成无机纳米材料或用于包埋活性营养小分子,亚基间界面则可用于调控铁蛋白分子的解离重组以及设计新型笼状蛋白。通过对这3 种活性界面的修饰和改造,可以拓展铁蛋白分子应用空间。
作为一种典型的笼形蛋白,铁蛋白分子通过亚基界面之间的复杂而精确的作用力自组装形成具有高度对称性的四级结构。参与铁蛋白笼状结构组装的亚基间界面包括C2、C3、C4以及C3-C4界面,其中C2和C3-C4界面是维持亚基间相互作用的主要区域(图1C)。

不同来源天然铁蛋白特征

动物铁蛋白通常由功能差异很大的H型(重链,分子质量约为21 kDa)和L型(轻链,分子质量约为19.5 kDa)两种亚基组成。H型亚基包含1 个亚铁氧化中心,可将二价铁离子氧化成三价铁离子。1 个亚铁氧化中心能够同时结合2 个二价铁离子,亚铁氧化中心包含2 个铁离子结合位点,A位点由Glu27、Glu61、Glu62、His65和Glu107 5 个氨基酸残基构成,B位点由Tyr34和Gln141两个氨基酸残基构成。L型亚基不具备氧化亚铁离子的功能,但其具有1 个成核中心,负责将氧化后的三价铁离子转化为矿化核。铁蛋白H和L亚基的比例在不同器官和组织中有所区别,脑、心脏等代谢旺盛的器官中铁蛋白富含H亚基,而脾脏和肝脏等器官中铁蛋白L亚基比例较高。H和L亚基可分别专一识别人体细胞的表面受体,一种是转铁蛋白受体(TfR)1,特异性识别铁蛋白H型亚基;另一种是清道夫A类受体5号蛋白,负责识别结合铁蛋白L型亚基。

铁蛋白的结构改造

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由于天然蛋白质的尺寸和形状比较单一,限制了其应用范围。于是科学家们通过人工设计构建新型铁蛋白纳米笼。铁蛋白分子4 种亚基间界面对铁蛋白笼状结构的形成非常重要,其中C3-C4界面的表面积最大,其次是C2、C3和C4界面。Zhang Shengli等通过在C3-C4界面关键位置插入或者删除氨基酸使24聚体铁蛋白分别转变为16聚体和48聚体笼形铁蛋白(图2A)。16聚体铁蛋白由两个相似的8聚体通过疏水作用连接在一起,形成扁球形中空结构。48聚体铁蛋白的外径则扩大为17 nm,其内部空腔容量大约是原来的4.3 倍,但在溶液条件下48聚体不稳定,会转化为直径约为10 nm的碗状8聚体铁蛋白。之后Zang Jiachen等以上述碗状8聚体铁蛋白为模板,通过设计链内二硫键和链间二硫键为作用力,分别成功将其转化为3 种新型的笼形蛋白:笼形24聚体(外径12 nm)、椭圆16聚体(长轴10 nm、短轴8 nm)以及笼形48聚体(外径17 nm)(图2B)。而当完全消除铁蛋白的C3-C4界面,即删除铁蛋白亚基羧基端49 个残基时,铁蛋白将转化为8聚体纳米环状结构(图2C)。该纳米环内壁仅由B螺旋组成,而其外壁由A螺旋、C螺旋和BC-环组成,其高度为5.1 nm,内外径分别为3.2 nm和7 nm。

2、铁蛋白在食品营养领域的应用

矿质元素载体

铁是生物体必需的微量元素之一,而缺铁性贫血(IDA)则是世界范围内最为普遍的一种营养素缺乏症,严重影响着人类的营养与健康,其主要原因在于铁摄入不足或过量消耗,因此科学家们在不断探索高效且安全的补铁制剂。目前,市场上常见的补铁剂主要是以硫酸亚铁或葡萄糖酸亚铁为代表,该类补剂虽然铁含量高、价格便宜,但性质不稳定且易受到食物其他组分的影响,同时会对人体产生一定副作用,如腹泻、呕吐、生长迟缓等。天然植物铁蛋白特别是豆科类种子中的铁蛋白,由于其广泛来源以及丰富的铁含量受到了科学家的关注,被认为是一种新型天然膳食的补铁因子。得益于蛋白质外壳的保护,植物铁蛋白的铁不容易受到膳食中螯合剂如植酸和单宁酸的影响。在豆科类种子中,90%以上的铁元素以铁蛋白的形式贮存在淀粉质体中,研究者比较了大鼠对硫酸亚铁与分离提取的大豆铁蛋白的铁吸收效果后发现,两组之间没有显著性差异,故大豆铁蛋白中的铁能被人体很好地吸收,具有与硫酸亚铁相似的补铁功效。铁蛋白可以抑制亚铁离子自氧化生成具有毒副作用的活性氧, 具有去毒作用,蛋白可作为一种植物来源的新型补铁制剂。

钙是人体含量最为丰富的无机元素,参与体内多种生理过程,对人体的生长发育、营养健康起着重要作用。目前我国缺钙现象仍然普遍,市场上补钙制剂主要分为无机钙、生物活性钙、有机钙以及氨基酸螯合钙等,这些钙制剂均存在一定的应用缺陷,随后以多肽或蛋白质为主要配体的钙制剂迅速发展,研究发现钙或其他矿物元素可以通过肽转运机制或蛋白质的特异性受体被小肠细胞所吸收。虽然乳制品是生物可利用钙的良好来源,但不适合于素食主义者等人群,因此开发植物来源蛋白质为载体的补钙制剂尤为重要。为解决上述问题,研究人员将钙离子装载进植物铁蛋白空腔中,制备得到铁蛋白钙复合物。细胞吸收实验发现,植物铁蛋白能够保护钙离子不受膳食抑制因子如草酸、单宁酸的干扰。此外,与已知的二价金属离子转运蛋白1(DMT1)介导的二价金属离子吸收途径不同,细胞可通过新的TfR1参与途径吸收铁蛋白-钙复合物,故铁蛋白包裹的钙离子不会干扰其他二价金属离子的吸收。随后,锌、铜、硒等多种矿物元素被装载到铁蛋白空腔已得到实验验证,其特殊的中空结构和笼形的蛋白质外壳可以克服金属离子溶解度低以及易受外界环境干扰的缺点,显著提高矿质元素的生物利用率。综上所述,铁蛋白作为矿质营养元素载体具有广阔的应用前景。


活性营养物质包埋

食品中存在着许多高生物活性小分子,如β-胡萝卜素、姜黄素、芦丁、花青素、叶黄素、原花青素等,这些物质被认为具有抗氧化、抗癌和抗炎症等生物活性,对于人体健康具有较大促进功能。然而这些化合物大多对于环境条件十分敏感,如水不溶性或光、热不稳定性等,这极大限制了其在营养和人类健康领域的应用,因此克服这些限制因素显得至关重要。近年来,动植物铁蛋白在食品科学和营养健康领域受到广泛关注,科学家们利用铁蛋白受pH值控制的可逆解离组装特性来包埋各种水溶性或脂溶性活性营养素。这一方法简单易行且环境友好,同时研究发现包埋后营养小分子的水溶性、光热稳定性和细胞摄取活性明显优于游离状态,铁蛋白分子同时还能防止包埋物质受到食品中其他成分的干扰。

重金属检测


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汞是一种剧毒重金属,其可通过食物链进行生物累积从而严重威胁着人体健康。汞化合物可以分为无机汞和有机汞。无机汞主要以二价汞离子(Hg2+)形式存在于环境中,摄入或吸入会对人神经、胃肠道系统以及内脏器官等产生严重危害,因此建立能快速准确检测汞离子的方法对于食品安全、人类健康以及环境检测等方面具有重要意义。目前,原子吸收光谱、原子发生光谱、电感耦合等离子体质谱、电化学法等仪器方法可用于检测Hg2+等重金属离子,但这些传统方法存在成本高、处理过程繁琐等应用缺陷。近年来,荧光探针检测技术由于其灵敏度高、选择性好、应用方便等优势逐渐受到了研究人员的广泛关注。Wang Yingjie等通过在HFn纳米笼外表面连接一段MBP,成功制备了一种对Hg2+具有高结合能力的蛋白纳米笼(HFn-MBP)。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的HFn-MBP的荧光可以被GO猝灭,而在上述体系中加入Hg2+可以以剂量依赖的方式恢复被猝灭的荧光(图4B)。该传感器由FITC标记的HFn-MBP和GO组成,对Hg2+具有较高的灵敏度和选择性,检测限可达1.0 nmol/L。此研究为铁蛋白纳米笼在重金属离子检测中的应用开辟了新的途径。


3、铁蛋白在生物医药领域的应用


抗癌药物递送

持续增长的癌症死亡率提示着肿瘤治疗仍存在着巨大的挑战,除了各种抗癌药物的研发,对于纳米药物载体的研究同样引起了广泛的关注。由于人重链铁蛋白可以特异识别TfR1,通过冷冻电子显微镜技术对TfR1与人重链铁蛋白的复合物结构解析发现,H型亚基A螺旋的氨基端、BC-环和C螺旋的羧基端是铁蛋白与TfR1结合的相应区域。TfR1在肿瘤细胞中过表达,利用其固有的肿瘤靶向性,人重链铁蛋白已被广泛用于装载顺铂、卡铂、奥沙利铂等铂类化合物、Dox、金基化合物(Au2phen和Auoxo4)、钌络合物(DiRu-1)等多种抗癌药物。研究发现铁蛋白作为药物载体能够穿越血脑屏障,实现对原位恶性脑胶质瘤的靶向治疗(图4C)。血脑屏障是维持中枢神经系统稳态和保护脑组织免受代谢物损伤的天然屏障,几乎所有大分子药物和大部分小分子药物无法穿越血脑屏障抵达脑组织,故中枢神经系统疾病如恶性脑瘤无法得到有效治疗。由于TfR1在脑内皮细胞和恶性肿瘤细胞中均能高表达,实验结果表明铁蛋白可通过脑内皮细胞的转胞吞作用穿过血脑屏障且不会阻断在溶酶体,又可以通过TfR1介导特异性富集到恶性脑瘤细胞的溶酶体中降解。铁蛋白包埋并靶向释放药物Dox从而靶向杀伤癌细胞。铁蛋白与TfR1特异性的靶向结合及理想的纳米尺寸效应是其既可以穿越血脑屏障又具有肿瘤组织高选择性的重要原因。

诊断及光热治疗

铁蛋白空腔的生物矿化能力以及表面易于修饰的特性使得铁蛋白成为了良好的生物成像设备,其在核磁共振成像(MRI)和PAI中得到了广泛的应用。MRI是一种强大的诊断技术,由于其高灵敏度和准确性,被广泛用于肿瘤成像。然而,目前使用的钆基造影剂缺乏对癌细胞的特异性导致假阳性出现,同时MRI由于空间分辨率不够可能无法检测到隐匿的肿瘤微沉积。Cao Changqian等通过在铁蛋白纳米笼内合成磁铁矿核作为MRI造影剂用于癌症的体内检测,其具备极高的造影性能和TfR1依赖的MRI信号。

结 语

由于铁蛋白具有单分散性、高溶解性、高生物安全性和高稳定性等优点,利用铁蛋白纳米笼状结构、解离自组装以及易于修饰的特性将活性物质或抗癌药物进行包埋和靶向递送具有重要的意义。经过铁蛋白包埋后,活性营养物质的水溶性、热稳定性、光稳定性和细胞摄取率均得到显著提高,药物分子能够精准地靶向杀伤肿瘤细胞,且能够穿越血脑屏障抵达脑组织。诸多研究表明铁蛋白可作为一种新的包埋生物活性物质的纳米载体。此外,在食品重金属检测以及活体成像诊断等方面,铁蛋白纳米载体也具有非常广阔的应用前景。尽管针对铁蛋白包埋物质的制备方法和应用已经取得了很大的进展,但仍存在一些问题需要解决。首先,铁蛋白的包埋效率以及装载能力仍需提高,通过人工设计更多不同形状和性质的新型铁蛋白纳米笼或制备蛋白组装体利用组装间隙的空间是可能的解决方案,但具体的应用体系需深入探索。其次,目前研究大多集中在铁蛋白包埋物质的制备方法和医药应用,铁蛋白纳米载体在食品营养与检测方面的应用应受到更多关注。最后,铁蛋白在胃中的稳定性以及客体分子的细胞摄取效率有待进一步提高,这样才能保证铁蛋白运载体系对人体营养与健康的贡献进入实际临床应用。

·通信作者简介·

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张拓,中国农业大学食品科学与营养工程学院副教授,特聘研究员。毕业于中国农业大学,获工学学士、博士学位,美国密歇根州立大学博士后。主要研究方向为蛋白质化学与营养,包括矿物元素营养与健康,微量元素受体及跨膜转运蛋白活性机理等。相关领域发表论文30余篇,代表性论文发表于Science Advances, Nature Communications, Science, Chemical Society Review, Critical Review in Food Science and Nutrition等领域内知名期刊。


本文《铁蛋白纳米载体在营养与健康领域的应用研究进展》来源于《食品科学》2022年43卷15期302-311页,作者:刘博,张晨曦,臧佳辰,吕晨艳,张拓,赵广华。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210730-359。点击https://www.spkx.net.cn/article/2022/1002-6630/2022-43-15-035.html即可查看文章相关信息。

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