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—— 中国食品杂志社
食源性致病菌能够改变食品的营养特性，危害人体健康，甚至威胁生命。为了预防和控制食品中的病原微生物，合成防腐剂在过去一段时间常被使用。然而研究发现，长期使用合成防腐剂会产生潜在的副作用。
01 胡桃醌的抗菌活性
如图1A所示，胡桃醌纯度≥98%。胡桃醌对大肠杆菌的MIC为0.0625 mg/mL，表明胡桃醌对大肠杆菌具有抗菌作用。如图1B所示，大肠杆菌对照组生长曲线可分为延迟期（0～1 h）、对数期（1～9 h）和稳定期（9 h后）。与对照组相比，在1/8 MIC胡桃醌条件下，大肠杆菌的生长几乎不受影响。在1/4 MIC条件下，对数期的大肠杆菌数量明显减少。此外，随着胡桃醌质量浓度的增加，大肠杆菌进入稳定期所需的时间也缩短，表明大肠杆菌的生长受到不同程度的抑制。当胡桃醌质量浓度达到1 MIC时，大肠杆菌的生长受到完全抑制。此外，大肠杆菌的抑制率与胡桃醌质量浓度呈正相关，表明胡桃醌的抗菌活性具有浓度依赖性。
02 胡桃醌对大肠杆菌膜通透性和完整性的影响
如图2所示，空白对照组和阴性对照组的相对电导率在实验过程中没有明显变化，表明加入少量无水乙醇对细胞膜通透性没有明显影响。培养7 h后，大肠杆菌会发生正常的溶解和死亡，故空白组和阴性对照组的相对电导率略有增加。当胡桃醌质量浓度从1/8 MIC增加到4 MIC时，处理1 h后，细菌悬液的相对电导率从（3.28±0.97）%增加到（16.89±1.81）%。随着培养时间的延长，大肠杆菌的相对电导率呈浓度和时间依赖性增加，这与前期研究报道结果一致。综上，胡桃醌可引起细胞膜损伤，导致细胞内成分泄漏和膜完整性丧失。
03 胡桃醌对大肠杆菌膜蛋白的影响
图3A显示了不同浓度KI对Trp和Tyr残基荧光发射光谱的影响。随着KI浓度的增加，Trp残基表现出明显的荧光猝灭（图3A1），表明Trp残基主要位于膜外。Tyr残基没有发生明显的荧光猝灭效应（图3A2），表明Tyr残基主要位于细胞膜或细胞间隙。图3B显示了不同质量浓度胡桃醌对Trp和Tyr残基的荧光发射光谱的影响。胡桃醌能有效地抑制Trp和Tyr残基的荧光强度。随着胡桃醌质量浓度的增加，Trp和Tyr残基的荧光强度明显降低。当胡桃醌质量浓度为1 MIC或2 MIC时，Trp和Tyr残基的荧光强度几乎消失，表明膜蛋白的结构被破坏。而且当胡桃醌的质量浓度为1 MIC时，其浓度远小于30 mmol/L KI的浓度。结果表明，相对于猝灭剂KI，胡桃醌可通过与膜蛋白相互作用更加明显地改变大肠杆菌细胞膜结构。
04 胡桃醌对大肠杆菌细胞表面疏水性的影响
如图4所示，阴性对照组与空白对照组间表面疏水性没有显著差异 （P＞0.05），说明少量的乙醇对大肠杆菌表面疏水性没有影响。而不同质量浓度胡桃醌处理的大肠杆菌细胞表面疏水性显著高于空白对照组（P＜0.01，P＜0.001）。同时，大肠杆菌的细胞表面疏水性与胡桃醌呈剂量效应关系。上述结果说明经胡桃醌处理后位于脂多糖外侧具有亲水结构的O-抗原多糖侧链可能被破坏，导致细胞之间的识别和细胞间物质的运输受到极大的影响。这与之前关于秸秆酚酸对金黄色葡萄球菌生物膜影响的实验结果一致，表明胡桃醌可以有效地增加大肠杆菌的表面疏水性，从而减少细菌对外界物质的吸收和降解，进一步影响细菌整体的活性。
05 胡桃醌对大肠杆菌膜形成和细胞活性的影响
如图5A所示，阴性对照组和空白对照组之间生物膜形成量没有显著差异（P＞0.05）。当胡桃醌质量浓度为1/8 MIC时，大肠杆菌生物膜的形成受到高度显著抑制（P＜0.001）。胡桃醌会影响生物膜的形成，但不同质量浓度胡桃醌对生物膜生成的影响区别不大。当胡桃醌质量浓度增加到1/4 MIC时，与阴性对照组相比，生物膜形成的抑制率从（3.14±1.26）%增加到（40.19±0.92）%，随质量浓度继续增加变化不再明显。综上，胡桃醌可有效抑制大肠杆菌生物膜的形成。
如图5B所示，阴性对照组和空白对照组之间的细胞活性没有显著差异（P＞0.05），并且随着胡桃醌质量浓度的增加，刃天青的荧光强度明显降低。当胡桃醌质量浓度达到1/2 MIC时，荧光强度达到较低水平，且不再随胡桃醌质量浓度的增加而发生明显变化，表明大肠杆菌活性和呼吸作用被完全抑制。可能的原因是大肠杆菌的细胞质膜上发生电子转移和氧化磷酸化。一旦细胞质膜被破坏，附着在膜表面的酶会受到不同程度的破坏，还原氢跨膜异常，电子不能在呼吸链中正常转移，ATP合成受阻、呼吸受到抑制导致，细胞活性完全丧失。
06 胡桃醌对大肠杆菌形态的影响
如图6A所示，未经处理的大肠杆菌保持正常的细胞形态，细胞壁完整，细胞膜和细胞质中电子密度均匀。如图6B所示，用1/4 MIC处理12 h的大肠杆菌细胞结构出现异常现象，包括细胞壁消失、细胞膜破裂、在胞内物质空腔中形成暗聚集体。如图6C所示，当胡桃醌质量浓度达到1 MIC时，细胞壁和细胞膜完全溶解，胞质内容物渗出，可见细胞膜碎片，细胞形态发生显著变化。此外，胡桃醌质量浓度越高，细胞损伤越严重。透射电子显微镜观察结果显示胡桃醌对大肠杆菌的细胞膜、细胞壁和胞内物质均有影响。研究表明抗菌剂对细菌细胞的形态有不同的影响，例如会导致胞质分离、细胞完全溶解和细胞中可见电子透明区域。因此可以推断，胡桃醌对大肠杆菌的抗菌作用可能是由于胡桃醌引起细胞壁和膜结构的直接改变，导致细胞死亡。
07 胡桃醌对大肠杆菌总蛋白合成的影响
如图7所示，无菌水处理和无水乙醇处理的大肠杆菌蛋白条带清晰，差异不明显；然而，随着胡桃醌质量浓度不断增加，蛋白质条带的分布发生了明显改变。经1/8 MIC胡桃醌处理6 h后，蛋白条带的数量没有明显变化，但蛋白条带的灰度变弱。在较高的胡桃醌质量浓度下，大多数蛋白质条带变得模糊或消失。其原因可能是胡桃醌影响大肠杆菌中核酸的合成和表达，阻碍蛋白质和酶的合成，导致细菌细胞中蛋白质水平降低，从而发挥其抗菌活性。
08 胡桃醌对大肠杆菌DNA和RNA合成的影响
如图8A所示，空白对照组和阴性对照组的电泳条带明亮紧凑（泳道1和泳道2），没有明显差异。然而，从不同质量浓度胡桃醌处理的大肠杆菌中提取的基因组DNA条带灰度逐渐减弱（泳道3～8）。当胡桃醌质量浓度达到1/4 MIC时，DNA出现明显损伤 （泳道4）。这些结果表明胡桃醌破坏了大分子DNA，从而干扰生物功能。与DNA不同，天然RNA是一种单链分子，更容易受到外来物质的影响。如图8B所示，在空白对照组和阴性对照组中，大肠杆菌的23S rRNA和16S rRNA条带均可见，无明显差异。当胡桃醌质量浓度达到1/8 MIC时，23S rRNA和16S rRNA可见，但部分降解。随着胡桃醌质量浓度的增加，23S rRNA和16S rRNA均被完全降解（泳道4～8），降解条带灰度变浅，甚至无法检测到。结果表明，胡桃醌对大肠杆菌RNA的影响更大。
09 紫外吸收光谱分析结果
10 分子模拟结果
如图10A所示，最佳结合构象的对接分数（结合能）为－5.85。从对接评分来看，小的靶分子可以稳定地与靶DNA结合。小目标分子和目标DNA连接后，生成DNA模型，如图10B所示，胡桃醌与DNA双螺旋的凹槽区域形成氢键，该区域被DNA A链（T7）和B链（A18、T19）的碱基对包围。胡桃醌中的O通过氢键与DNA A链T7的 —NH2中H结合，结合距离为2.7 Å。DNA B链A18和T19的两个H在—NH2之间形成的氢键结合距离分别为1.8 Å和3.2 Å。综上，胡桃醌通过进入DNA的小凹槽与DNA相互作用，该相互作用主要通过氢键实现。
结 论
本研究中，为了探索胡桃醌可能存在的抗菌机制，分析了胡桃醌对大肠杆菌膜的完整性、膜通透性、细菌活性、细胞形态、膜表面疏水性、膜蛋白以及胡桃醌对大肠杆菌基因组DNA之间相互作用的影响，通过分子对接技术模拟了胡桃醌和大肠杆菌DNA的结合位点，全方位地阐释胡桃醌对大肠杆菌的抗菌机制。结果表明，胡桃醌能够破坏大肠杆菌的细胞质膜，膜完整性的丧失导致细胞内容物的泄漏。此外，相对电导率和荧光发射光谱分析结果表明胡桃醌对大肠杆菌的抗菌活性可能部分通过与膜蛋白的相互作用来实现。透射电子显微镜的结果能够验证以上结论，细胞壁和细胞膜发生溶解，细胞内容物流出，综上，推测细胞膜蛋白可能是胡桃醌的作用靶点之一。此外，由凝胶电泳分析结果可知，在破坏细胞膜后，胡桃醌进一步与DNA和RNA结合，抑制大肠杆菌遗传物质的复制、转录和翻译；通过紫外光谱和分子对接实验验证了胡桃醌和大肠杆菌的DNA的结合方式和结合位点，进一步推测大肠杆菌的DNA可能是胡桃醌的另一个靶点之一。虽然可能存在其他机制抑制大肠杆菌的整体活性，但可以得出结论：胡桃醌能够通过破坏细菌膜并与细胞内DNA结合来有效杀死大肠肝 菌。本研究可为胡桃醌在食品工业中作为天然生物食品防腐剂应用提供参考。
通讯作者简介
毛晓英，博士，教授，硕士生导师。主要从事蛋白质结构与功能研究，相继主持及参与国家自然科学基金3项、国家星火计划项目1项兵团重点科技攻关计划2项，农二师科技攻关项目1项、南昌大学食品科学与技术国家重点实验室开放基金课题1项，石河子大学高层次及优秃青年项目及八师科技项目等等课题20余项，发表科研论文70余篇，其中SCI收录5篇，E收录6篇，出版专著2部，参编教材2部.获省部级科技进步奖1项，获石河子大学教学成果二等奖1项。担任《食品科学》《食品工业科技》等期刊的审稿人，获授权专利1项。
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