金樱子果实多糖提取物通过靶向高脂饲料喂养的大鼠的氧化还原平衡和肠道界面减轻炎症性肥胖

2023-08-16 16:49:08

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Introduction

肥胖被认为是当前的一个全球性健康问题，它会增加慢性代谢性疾病的风险，包括慢性炎症、糖尿病、高血压等，给社会和经济带来负担。虽然遗传和环境因素被认为是肥胖的主要原因，但其基本原因被归因于膳食摄入和能量消耗之间的不平衡。科学家们越来越关注有效的治疗方法，其中天然多糖被用作潜在的功能性成分或具有强效抗肥胖和抗炎活性的候选药物。以往的研究发现肥胖与炎症反应和人体肠道菌群相关。肠道菌群失调易诱发慢性和轻度炎症，与肠道菌群紊乱和肠道通透性改变后肥胖风险的增加有关。大多数居民具有消化食物和调节免疫的功能，这是由于存在稳定的微生物生态系统。肠道菌群紊乱不仅与肥胖的流行有关，而且与代谢综合征密切相关。

除了淀粉和糖原之外，天然多糖是长链单糖聚合物碳水化合物，具有多种功能。它们可以减少氧化应激，减轻炎症，改善免疫力和肥胖以及改善肠道菌群组成。特别是来自传统中草药植物的功能性多糖，如灵芝、海巴戟、沙棘和牛蒡，显示出各种补益效果。从麦冬根中提取的多糖对减肥和降血糖具有强效作用，主要通过降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例和调整紊乱的肠道菌群至正常状态来实现，具有复杂的生物转化过程。

在东方国家，尤其是中国南方地区，金樱子（Rosa laevigata）及其果实作为药物或食品已经安全使用了数千年。最近的研究表明，这种特殊的果实在体外和体内都具有多种药理作用，包括抗氧化特性、降血脂作用、抗炎作用、免疫调节作用、心血管保护作用和神经保护作用，这些作用被认为归因于各种活性化合物的存在，如三萜类化合物、类固醇、酚类、单宁、有机酸和多糖。以往的研究表明，从金樱子果实中提取的多糖具有降血脂、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤和神经保护活性。

金樱子果实中均一多糖结构的表征和生物筛选，对于进一步开发金樱子果实至关重要。结合之前的研究，关于金樱子果实中低分子量多糖的活性报道很少。在先前的研究中，从金樱子果实中提取了低分子量多糖（RLPs）并对其结构进行表征。本研究旨在评估RLPs在高脂饮食（HFD）喂养的大鼠中对炎症性肥胖和肠道菌群平衡的影响，并通过多组学方法进一步阐明其潜在的分子机制。

Results

多糖对体质量增加和胰岛素抵抗产生影响

超重是肥胖的一个重要临床症状。高脂饮食组体质量增加了（316±10.71）g，显著高于正常组、高剂量LPs组和低剂量LPs组。模型组的Lee指数和肝指数水平与正常组相比显著增加，而在RLPs治疗下得到缓解（图1）。此外，RLPs治疗使脾指数显著降低，而胸腺指数增加（图1C）。

与高脂饮食组相比，高剂量RLPs组分别降低了TG、TC、游离脂肪酸和LDL-C水平，并且高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著增加，表明高剂量RLPs干预具有更强的降脂作用，而低剂量RLPs的降脂作用较弱。空腹血糖（FBG）水平在高脂饮食组与其他组之间存在显著差异（图1D），口服葡萄糖耐量试验（OGTT）显示高剂量RLPs改善了高脂饮食诱导的大鼠葡萄糖耐量下降（图1E）。高剂量RLPs治疗时，胰岛素水平和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR指数）分别为（2.39±0.31）μg/L和15.58±2.75，与高脂饮食组相比显著降低（图1F）。

综上表明，RLPs通过控制体质量、降低高脂饮食引起的血清胰岛素水平和改善胰岛素抵抗力来发挥其抗肥胖作用。

图1 RLPs对体质量增加（A）、Lee指数（B）、器官指数（C）、空腹血糖（FBG）（D）、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）（E）、胰岛素（FINS）（F）和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR指数）（G）的影响

RLPs减少了脂质积累、过氧化反应和肝脏损伤

炎症性肥胖相关的组织和器官损伤是临床诊断的关键指标。因此，对肝脏、附睾脂肪和结肠的H&E染色结果进行了研究，以探讨RLPs对大鼠组织的临床效果。如图2A所示，高脂饮食导致肝细胞的脂滴积聚和气泡状变性增加，而这一结果在RLPs干预后被逆转，并与剂量有关。在图2B中，高脂饮食导致附睾脂肪细胞肥大且数量减少，而补充RLPs则缓解了这种影响。在高脂饮食组中，肠黏膜上皮细胞不断受损并消失，腺体变形，但RLPs治疗显著改善了结肠的病理变化（图2C）。

ALT、AST和GGT的水平在临床上被作为检测肝损伤的生物标志物。高脂饮食组显示ALT、AST和GGT的升高，而RLPs治疗则呈现相反的趋势（图2D-F）。此外，与CN组相比，高脂饮食组肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性明显降低。然而，RLPs治疗显著提高了GSH-Px的活性（图2G）。

从上述结果可以看出，RLPs可以减轻高脂饮食引导的肝脏损伤，并减轻大鼠体内的氧化应激。

图2 RLPs减少了肝脏脂滴（A）、附睾脂肪细胞增大（B）、结肠粘膜损伤（C）和血清中ALT（D）、AST（E）和GGT（F）的水平，以及肝脏GSH-Px的水平

RLPs对血清中与炎症相关的细胞因子的影响

本研究检测了血清中5种细胞因子，以评估RLPs的抗炎作用。结果如图3所示，HFD组中的TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1血清水平显著增加，而IFN-γ水平降低，表明高脂饮食可以引发内部炎症反应。经两种测试剂量的RLPs干预后，TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的升高得到有效抑制。如图3E所示，在与HFD组相比，RLPs处理组中IFN-γ的分泌量显著增加。此外，RLPs还显著下调IL-1受体1（IL-1r1）和LPS结合蛋白（Lbp）的表达（图3F），它们是NF-κB途径的上游基因。

图3 RLPs对TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）、MCP-1（D）、IFN-γ（E）等炎症细胞因子水平以及大鼠肝脏中Lbp和IL-1r1基因表达的影响（F）

RLPs对肝脏脂质代谢和氧化还原平衡的影响

如图4A所示，对喂养HFD的大鼠肝脏组织进行RNA-seq分析，HFD组和CN组共获得1566个DEGs，包括783个上调的DEGs和783个下调的DEGs，HRLP组和HFD组之间的DEGs为1109，其中579个为上调的DEGs，530个为下调的DEGs。Venn图反映了三个比较组（HRLP vs HFD组，LRLP vs HFD组和HRLP vs LRLP组）中的DEGs数量（图4B）。这三个比较组中独有的DEGs数量分别为695个、278个和333个，共有的DEGs数量为12个。对于HRLP和HFD之间的DEGs，GO术语中显著富集了49个生物过程和7个分子功能。这49个生物过程主要分为氧化还原过程、脂质代谢过程、小分子代谢过程、碳水化合物代谢过程和ATP代谢过程等，而这7个分子功能主要包括氧化还原酶活性和调节区域的DNA结合。

图4 RLPs对相关途径和肝脏基因表达的影响

结果表明，RLPs的干预改变了与脂质代谢和氧化还原过程相关的基因的表达。通过KEGG分析，发现差异基因主要位于过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）信号通路、类固醇生物合成途径、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、细胞色素P450介导的异物代谢和非酒精性脂肪肝（NAFLD）途径（图4C和4D）。PPARs在调节肝脏脂质代谢方面发挥着重要作用。PPARs包括PPARα、PPARβ和PPARγ，它们在脂肪代谢中具有不同的功能。如图5所示，与HFD组相比，HRLP组中脂肪酸氧化基因Acox3和硬脂酰辅酶A去饱和酶基因Scd的表达显著增加，这表明RLPs能够增强脂肪酸氧化并调节长链脂肪酸的代谢。

如图4C所示，HFD增加了Cyp2e1的表达，使用RLPs进行干预明显降低了其表达。结果表明HFD可导致大鼠的氧化应激，而RLPs通过减轻氧化应激来改善脂质代谢，以维持氧化还原平衡。

图5 RLPs处理引起的PPAR和氧化应激信号通路的紊乱

RLPs影响短链脂肪酸（SCFAs）的产生

肠道菌群产生的SCFAs在维持宿主健康方面起着重要作用。对4组大鼠的粪便中SCFAs的水平进行了检测（表1）。总体而言，结果表明，与正常对照组相比，高脂饮食（HFD）降低了SCFAs的水平。与HFD组相比，RLPs处理组的大鼠在丙酸、丁酸、异戊酸和戊酸的含量上显示显著增加。

表1 RLPs对SCFAs产生的影响

RLPs对肠道菌群组成的影响

16S rRNA基因测序和宏基因组基因测序被用于分析肠道菌群的组成、特征和相对丰度。微生物群落的多样性和丰富度可以通过α-多样性分析来反映。α-多样性由观察到的物种数、Chao指数和Shannon指数反映。其中，Chao指数和观察到的物种数指数代表着肠道菌群的丰富度，数值越高表示丰富度越高，而Shannon指数代表着肠道菌群的多样性，Shannon指数越低表示多样性越高。如表2所示，与CN组相比，HFD显著降低了Chao指数和观察到的物种数指数，同时也显著降低了Shannon指数，这表明HFD导致了大鼠肠道菌群的丰富度和多样性的降低。RLPs的干预增加了Chao指数和观察到的物种数指数，但差异不显著。这些结果表明，RLPs在一定程度上可以增加高脂饮食下大鼠肠道菌群的丰富度。此外，4组的覆盖率指数都很高，平均值为0.998，这表明序列相似性大于97%，测序结果很好地反映了肠道菌群的实际状况。

表2 各组的α-多样性指数

图6 通过16S rRNA测序与宏基因组测序相结合，RLPs改变了肠道微生物群落，并与血液参数进行相关性分析

大鼠经HFD处理后，肠道屏障受到破坏，肠道环境发生改变，这将导致肠道菌群组成的变化。在物种水平上，主要包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），而它们在四个组中的分布模式是不同的。如图6A所示，与CN组相比，HFD组中Firmicutes的相对丰度增加，而Bacteroidetes和Proteobacteria的丰度下降。然而，RLPs的补充逆转了这个结果。每组中一些主要的分类群列在表3中。高剂量RLPs补充增加了Bacteroidaceae、Akkermansiaceae、Prevotellaceae和Oscillospiraceae的丰度，而Clostridiaceae和Ruminococcaceae的丰度则随着RLPs的补充而剂量依赖性地减少（图6B）。HFD组的Firmicutes/Bacteroidetes比例升高，但RLPs的补充使其降低（图6C）。在属水平上的进一步分析显示，RLPs增加了Akkermansia、Alistipes和Prevotella的相对丰度，降低了Dorea和Blautia的相对丰度（图6D）。

表3 各组在门水平上肠道菌群的差异

经宏基因组测序在物种水平上鉴定粪便样本中的细菌。采用Spearman相关分析研究肠道菌群与血清生化特征之间的相关性。

结果如图6E所示，血清中TG、TC、FFA、ALT、AST、葡萄糖、IL-6和MCP-1水平与Bacteroidales bacterium 52-46、Prevotella sp. CAG.1031、Lachnospiraceae bacterium 10.1、Lactobacillus murinus、Helicobacter rodentium、Helicobacter sp. MIT.05.5294、Treponema succinifaciens和Treponema porcinum的相对丰度之间存在显著的负相关。此外，与Clostridium sp. CAG.451、Clostridium sp. CAG.58、Clostridium cocleatum、Firmicutes bacterium CAG.102、Firmicutes bacterium CAG.110、Firmicutes bacterium CAG.424、Dorea sp. CAG.317、Gemmiger sp. An120、Roseburia sp. 499、Bacteroides caecimuris和Mycoplasma sp. CAG.877的相对丰度之间存在显著的正相关。

Discussion

本研究采用多组学方法探索了RLPs在高脂饮食大鼠中抗炎特性的潜在机制，结果显示RLPs通过控制体质量、降低血脂和血糖指标、调节氧化还原信号通路以及调节肠道菌群对炎症性肥胖具有保护作用。这些数据揭示了RLPs作为潜在的药物候选物，在调控与氧化还原相关的疾病方面具有潜在的化学预防作用。

在当前的研究中，RLPs通过增强抗氧化酶GSH-Px的活性来抑制极端胆固醇引起的氧化应激。HFD引起的高水平的TNF-α和IL-1β导致氧化应激的发生，与肝脏GSH-Px的降低以及ALT、AST和GGT的增加相一致。因此，减少HFD引起的氧化应激可以预防肝损伤。Cyp2e1是氧化应激产生的关键因素，也是微粒体乙醇氧化系统中最关键的酶。在本研究中，经RLPs的干预后，Cyp2e1的表达被下调。

LPS通过Lbp的处理和运输以及巨噬细胞的激活，可以通过TLR4介导的炎症途径来处理。RLPs的干预下调了LBP和IL-1R1的表达，在HFD喂养的大鼠中也降低了这些蛋白的表达，这可能部分是通过减少TLR4介导的炎症途径的激活实现。此外，RLPs通过激活PPAR信号传导，增加Acox3和Scd的表达，促进了脂肪酸氧化。因此，认为RLPs可以通过激活Cyp2e1、Toll样受体信号通路和PPAR信号传导途径来调节肝脏脂质代谢和与氧化还原相关的疾病。

从金樱子中提取的具有不同极性、分子量和结构的多糖具有不同的生物活性。如从金樱子提取并纯化的中性水溶性多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。主要由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，包含→5)-α-L-Araf-(1→,→2,5)-α-L-Araf-(1→,→3,5)-α-L-Araf-(1→,→4)-α-D-Glcp-(1→,6)-α-D-Glcp-(1→,→3,6)-β-D-Glcp-(1→,→4)-α-D-Galp-(1→,→6)-β-D-Galp-(1→,→2)-β-D-Xylp-(1→,末端α-L-阿拉伯糖和末端β-D-甘露糖。这种多糖显示出免疫调节和抗肿瘤活性。从金樱子果肉中分离得到的一种酸性多糖，其分子量为137123 Da，呈三螺旋构象。它由鼠李唐（7.6%）、阿拉伯糖（26.5%）、木糖（3.5%）、甘露糖（0.9%）、葡萄糖（5.7%）、半乳糖（31.9%）和半乳糖醛酸（23.9%）组成，并含有16种糖苷键。

RLPs改善了SCFAs的产生，降低了厚壁菌/拟杆菌比例，并增加了Akkermansia和拟杆菌的相对丰度，这有助于肠道屏障功能。因此，RLPs的抗肥胖效应可能是通过激活PPARs信号通路，增加肠道中SCFAs的水平以及改善肠道细菌组成从而改善脂质代谢异常和抑制高脂饮食大鼠肥胖的形成。

高脂饮食增加了厚壁菌的丰度，降低了拟杆菌的丰度。在高脂饮食中补充RLPs剂量依赖性地增加了拟杆菌的相对丰度，并降低了厚壁菌的丰度。

本研究结果表明，RLPs可能有选择性地调节与炎症和肥胖有关的某些细菌。肠道微生物群失调显示厚壁菌门（Firmicutes）的显著增加，包括Clostridiaceae和Lachnoclostriaceae，而拟杆菌门（Bacteroidetes）中的某些属，如Alistipes、Butyricimonas、Paraprevotella和Akkermansia，则显著减少。研究结果显示，RLPs增加了丁酸单胞菌和阿克曼氏菌的丰度，并可能预防慢性炎症。本研究还发现，在高脂饮食组中，Prevotella和Alistipes的表达下调，而在高RLPs组中则上调。

Conclusion

本研究采用了3种组学方法来研究RLPs抑制炎症性肥胖的分子机制。经过不同维度的多样性相关分析，发现RLPs的干预可能有助于一些肠道微生物的稳定，特别是在饮食诱导的微生物失衡情况下，并影响相应的代谢途径，有助于维持宿主的健康。在临床应用之前应进行进一步的深入研究，并获得更有说服力的分子证据，以揭示RLPs的生物功能的全面分子机制。

Polysaccharide extract from Rosa laevigata fruit attenuates inflammatory obesity by targeting redox balance and gut interface in high-fat diet-fed rats

Xuejiao Zhang^a,b, Chenzhong Jin^c, Yihong Hu^c, Yunyun Zhou^c, Weiguo Wu^a,*, Si Qin^a,*

^a Lab of Food Function and Nutrigenomics, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

^b College of Food and Chemical Engineering, Shaoyang University, Shaoyang, 422000, China

^cCollaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, China

*Corresponding author.

Abstract

Low-molecular-weight polysaccharides (RLPs) extracted from Rosa laevigata fruits showed multiple biofunctions in Asia. This study aimed to investigate its anti-inflammatory obesity effect in high-fat diet-fed rats and further elucidated the underlying molecular mechanism by multi-omics methods. The results showed that RLPs administration had significantly restored immune organ indexes and reduced body weight gain. RNA-seq revealed that the effect of RLPs was partially attributed to its regulation on PPARs signaling by increasing the expressions of Scd, Acox3 and Hmgcs2, and on other redox-related pathways by decreasing the expressions of Cyp2e1, Il1-r1 and Lbp. Moreover, 16S rRNA sequencing coupled with metagenome sequencing showed that RLPs had significantly reduced the ratio of Firmicutes/Bacteroidetes from 8.01 to 2.37, and significantly increased the relative abundances of Alistipes, Prevotella, and Akkermansia from 0.36 %, 1.10 % and 2.61 % to 0.65 %, 2.37 % and 4.42 %, respectively. Spearman correlation analysis result indicated that the abundances of Lachnospiraceae, Prevotella and Bacteroidales were significantly negatively correlated with obesity phenotype, liver function and inflammatory factors. These results revealed that RLPs exerted significant anti-inflammatory obesity property partially via regulation on gut microbiota interface and the redox balance. Therefore, RLPs could be a promising functional food resource with the potential for redox imbalance-related diseases chemoprevention.

Reference:

ZHANG X J, JIN C Z, LIU H, et al. Polysaccharide extract from Rosa laevigata fruit attenuates inflammatory obesity by targeting redox balance and gut interface in high-fat diet-fed rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 442-453. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.046.

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