噬菌体是侵袭细菌的病毒，寄生于活菌体内，在自然界中广泛分布。将噬菌体合理地应用于食品工业中，能够专一地杀灭包括耐药菌在内的特定菌株，而不对其他细菌造成任何影响。噬菌体可弥补传统抗生素及杀菌技术的不足，在控制食源性致病菌的污染方面具有良好的应用前景。 在“农场-餐桌”的食品供应链中，大量研究报告了噬菌体能够有效抑制食源性致病菌的生长，且不会影响食品的感官特征。但噬菌体在食品工业中的实际应用相对较少，其原因主要包括一些技术的限制和消费者的接受程度。因此，需要进一步评估噬菌体的安全性和有效性，以确保它们在食品工业中安全、高效的使用。 上海海洋大学食品学院的惠潇然，黄振华，张昭寰*等系统地综述了限制噬菌体在食品领域中广泛应用的原因，涵盖了噬菌体在食品工业中应用的可接受程度、潜在耐药传播风险、细菌的噬菌体抗性问题、复杂的食品基质对其作用效果的影响，并对噬菌体在食品工业中的应用方式提出了科学合理的建议，以推动噬箘体的基础研究走向食品工业的实际应用。
噬菌体在食品及食品相关环境中的杀菌效果得到了广泛的研究，可抑制多种食物中的致病菌和腐败菌，如水果、蔬菜、肉制品、乳制品和水产品等。2006年，美国食品和药品管理局（FDA）推出第一款可用于食品工业的噬菌体产品ListShieldTM，用于即食食品肉类和家禽产品中单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）（Listeria monocytogenes）的控制。国内对噬菌体的研究主要集中在临床医学和农业方面。在食品工业中，对噬菌体的应用研究主要集中在对肉质品中的食源性致病菌的控制。目前我国还未批准相关应用于食品的噬菌体产品，这与消费者对噬菌体应用于食品的可接受程度密切相关。 相对于新兴技术加工的食品而言，多数消费者更加倾向于传统技术加工的食品。尽管利用噬菌体杀菌是一种绿色、安全和靶向的抗菌手段，但其作用方式是在食品表面喷洒“病毒活体”，导致广大消费者对这种杀菌技术的接受程度较低。病毒在普通大众的固有观念中是有害的，所以消费者很难接受应用噬菌体技术加工的产品。尽管噬菌体技术背后的科学原理十分明确，但消费者对于未知事物的不了解甚至误解，某种程度上限制了噬菌体在食品工业中的应用。 近年来，人们在农业生产过程中抗生素的滥用问题，促使大量抗生素通过农业废弃物释放到环境中，对微生物群落造成选择性压力，从而导致了耐药菌和耐药基因的选择和传播。目前，来源于各类水体、土壤、畜禽以及人体粪便分离的噬菌体中，均检测出不同种类的抗生素耐药基因（ARGs），如β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、甲氧西林、磺胺类等。如表1所示，噬菌体携带了较高水平的β-内酰胺类耐药基因（主要集中于blaTEM和blaCTX类）和喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB和qnrS，以及一些其他的耐药基因，如磺胺类耐药基因sul1和sul2、四环素类耐药基因tetA、tetW和tetM以及万古霉素耐药基因vanA等。随着测序手段的进步，研究人员利用宏基因组学的方法同样也检测到了噬菌体携带各种ARGs，这表明噬菌体可以被视为一种ARGs的储存库。
研究发现，大约20%的细菌基因组是通过噬菌体样元件而获得，其介导细菌间基因转移的主要方式为转导或溶源转变。转导是通过噬菌体介导外源DNA转移的过程，携带耐药基因的噬菌体感染细菌后，可能会将耐药基因重组到感染细菌的基因组中，从而使其获得新的遗传特性。溶源性转变是指温和型噬菌体基因组在宿主基因中的整合，当温和型噬菌体感染细菌细胞时，噬菌体DNA整合到宿主细胞染色体上，此时原噬菌体基因的表达将导致宿主表型的变化，形成的溶原细胞可以在不产生噬菌体颗粒或有害噬菌体蛋白的情况下生存。因此，噬菌体能够在ARGs的传播中发挥重要的作用，造成细菌耐药性传播的风险，限制了其在食品工业中的实际应用。 在噬菌体应用研究中发现，细菌的噬菌体抗性问题使得噬菌体在食品工业的生物防治效果明显降低。尤其是在控制食源性致病菌方面，在噬菌体与细菌不断进化的过程中，细菌抵抗噬菌体的能力也在不断地提升，从而导致噬菌体用于抑制细菌的效果并不理想，这大大限制了噬菌体在食品工业中的应用。 噬菌体生物防治只能在短期内抑制食源性致病菌的生长，不久之后细菌可恢复生长（表2）。很多研究均报道了噬菌体只可短期内有效降低食品中致病菌的数量，而不能够完全清除。产生这一现象的原因可能是出现了抗噬菌体突变株，使噬菌体无法彻底杀灭细菌。
在应对噬菌体侵袭的过程中，食源性致病菌进化了各种免疫系统来抵御噬菌体的感染，主要有吸附抑制（AI）系统、超感染排斥（Sie）系统、限制修饰（RM）系统、CRISPR-Cas系统、流产感染（Abi）系统和毒素-抗毒素（TA）系统（图1）。
阻止噬菌体的吸附（AI系统）
噬菌体的吸附是噬菌体感染细菌的第一步（图1）。噬菌体感染成功的关键是噬菌体与细菌表面受体特异性结合，因此受体变异就会使噬菌体无法吸附，从而导致噬菌体感染失败。在长期进化中，细菌已经进化出许多表面结构来阻止噬菌体的吸附，这一阻断机制主要包括：噬菌体受体基因突变或修饰、竞争性抑制剂的竞争抑制、胞外基质的覆盖、噬菌体自身编码的蛋白与其受体蛋白结合。
噬菌体DNA的侵入是噬菌体感染细菌的第二步（图1）。Sie系统最初在温和噬菌体中被发现，是阻止噬菌体DNA进入宿主细胞的主要机制，当宿主细胞被噬菌体感染后，同一类噬菌体再次感染宿主细胞时，这种多为膜锚定蛋白或与膜成分相关蛋白就会发挥作用，从而阻止同类噬菌体的再次感染。切割噬菌体DNA（RM系统和CRISPR-Cas系统） 噬菌体的生物合成是噬菌体感染细菌的第三步（图1），RM系统普遍存在于细菌与古细菌的噬菌体防御机制中，该系统主要由MTase和REase组成。在噬菌体在完成吸附和侵入后，RM系统作为免疫系统攻击进入细胞的噬菌体DNA，其中REase主要识别并切割特异DNA序列，当噬菌体DNA进入宿主细胞后，REase会识别并切割特定的位点，破坏噬菌体DNA，而宿主细胞DNA上的相同位点则被MTase甲基化，以保护自身DNA不被REase切割。RM系统根据作用机制和亚基可成分为4 种类型，即I～IV型。I型和III型RM系统相似，REase都沿着DNA移位，并从识别位点切割，在II型RM系统中，REase在DNA识别位点内部或附近进行切割，IV型系统由于缺乏MTase，只能切割修饰过的DNA。最近发现的一种新的防御系统——限制-修改相关的防御岛系统（DISARM）能限制噬菌体的DNA进入，类似于RM系统，是一种新型的多基因限制性修饰模块。
CRISPR-Cas系统是由一个含有短且保守的重复序列的CRISPR基因组位点以及由Cas编码的Cas蛋白组成。到目前为止，CRISPR-Cas系统一共可分为两大类（一类是由多个蛋白组成的效应蛋白模块；另一类是单个蛋白效应模块），共有6 种类型（I～VI型）和33 种亚型。噬菌体在完成吸附和侵入后（图1），该系统通过识别和切割外源的DNA或RNA，以一种序列特异性发挥作用，其行使功能分为3 个阶段：获取间隔序列、crRNA的生物合成和目标干扰。当噬菌体DNA第一次进入细菌细胞时，两种蛋白质Cas1-Cas2复合物会选择一部分外源DNA序列（原间隔序列）纳入CRISPR序列中，形成一段新的间隔序列，这一过程使宿主细胞记住噬菌体的DNA。随后这段间隔序列就会被转录成一个长前体crRNA（pre-crRNA），该前体crRNA进一步加工成含有噬菌体序列的成熟crRNA。最后在成熟的crRNA引导下，Cas核酸酶利用crRNA通过互补碱基配对来识别和切割噬菌体的DNA。
噬菌体的组装和释放是噬菌体感染细菌的第四步（图1），当噬菌体DNA成功入侵后，Abi系统能够干扰噬菌体复制周期的各个环节，阻止子代噬菌体的释放，同时导致宿主细胞的死亡。该系统主要是由单一蛋白质或蛋白质复合物组成，通常在噬菌体侵入后被活化，是单个细菌为保护周围细菌的一种自我牺牲的过程，主要通过干扰细菌细胞DNA的复制、转录和翻译来实现。Abi系统种类较多，在乳酸乳球菌中发现有20 种Abi系统（AbiA～AbiZ）。 TA系统广泛存在于细菌中，主要依靠一个毒素和一个抗毒素组成的防御系统。该系统的基本特点是抗毒素具有不稳定性，必须连续表达才能与毒素保持适当的化学计量比。TA系统中的毒素包括脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase），可以抑制DNA复制、ATP合成。以植物致病菌萎缩果胶杆菌为例（图1），ToxI和ToxN组成了一个TA系统，其中ToxN可以抑制细菌生长，在噬菌体感染后导致ToxN释放并降解细菌细胞RNA，导致噬菌体和细菌细胞死亡。 在噬菌体应用于食品工业的过程中，复杂的食品基质也是影响噬菌体作用效果的重要因素，主要包括食品的pH值、温度、化学成分等。这些因素往往是食品自身的固有属性，很难通过工艺优化的方式进行消除，限制了噬菌体在此类食品环境中的实际应用。 食品pH值是影响噬菌体杀菌效果的重要参数之一，研究表明，噬菌体在蜜瓜上的应用效果优于苹果，研究者认为噬菌体的感染可能受到苹果酸性的影响。 食品的温度是影响噬菌体作用效果的另一因素，例如，在4、10 ℃和20 ℃条件下，用噬菌体P100处理接种4（lg（CFU/cm2））单增李斯特菌的干腌火腿片，结果发现在4 ℃比条件下噬菌体的杀菌效果最好。用商业噬菌体混合制剂处理奶酪时，观察到不同温度对噬菌体的影响效果不同，在22 ℃下噬菌体杀灭单增李斯特菌的效果最好，比6 ℃条件下多杀灭0.79（lg（CFU/g））单增李斯特菌，但22 ℃不适合贮存奶酪，这种条件下会促进霉菌和其他腐败菌的生长。 食品中的蛋白质、脂质等化学成分会干扰噬菌体与特定宿主细胞受体之间的相互作用，从而影响噬菌体的作用效果。Gill等发现牛乳中的乳清蛋白因吸附在细菌细胞表面，阻断了噬菌体的结合，从而影响噬菌体对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。Garcia等在半脱脂牛奶和全脂牛奶中检测了噬菌体对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，结果发现噬菌体ΦH5和ΦA72混合处理后，半脱脂牛奶中的金黄色葡萄球菌数量下降了2（lg（CFU/mL）），而对全脂牛奶中的金黄色葡萄球菌几乎没有抑制作用。 噬菌体在食品工业中应用的可接受程度较低，其本身还具有潜在传播耐药性的风险，在控制食源性致病菌时，细菌对噬菌体产生的抗性问题以及复杂的食品基质对其作用效果的影响等诸多问题限制了噬菌体在食品工业中的实际应用。但是，噬菌体具有易于分离、资源丰富、特异性强等优势，若对其进行合理的开发、提高应用效率、控制潜在风险，能够有助于突破其在食品工业应用中的局限性。基于此，本文进一步对噬菌体在食品工业中的发展及应用提出以下三点建议。 基于大量关于噬菌体的基础研究，向食品行业以及广大消费者进行噬菌体的科普宣传，使其充分了解噬菌体具有高效、安全、靶向等优势，并通过微信、短视频等新兴媒体，科学合理地普及噬菌体相关信息，提高噬菌体在食品工业应用中的可接受度。此外，可根据每种噬菌体的最佳条件优化食品工艺，在不影响食品风味的情况下，使噬菌体在食品中发挥作用，从而推动噬菌体的基础研究走向食品工业化应用。5.2 基于多组学技术严格筛选可用于食品加工的优质噬菌体菌种
噬菌体在自然界中普遍存在，将其作为生物防控剂应用于食品时必须严格筛选，从基因组学、蛋白组学等多组学技术上严格把控，筛选出不携带耐药基因、毒力基因等风险因素的优质噬菌体菌种，为噬菌体在食品领域中的应用提供科学依据和数据基础，研发安全、高效的噬菌体类食品添加剂，从而为食品安全的切实保障提供可靠的防控策略。 大部分噬菌体都能编码相应的裂解酶，具有裂解活性强、安全性高、易于改造等优势，在食品实际生产过程中，可以使用噬菌体裂解酶代替噬菌体活体，其不仅具备噬菌体的特异性优势，而且不易改变食品的质地和口感，能够较好地克服噬菌体应用的局限性。因此，今后可以将噬菌体裂解酶作为研究目标，发掘出裂解活性高、稳定性强、宿主谱广的噬菌体裂解酶，以应用于食品工业领域。 本文《噬菌体在食品微生物安全领域中应用的局限性和挑战》来源于《食品科学》2023年44卷第13期338-345页，作者：惠潇然，黄振华，刘 静，吴 倩，许天明，段为旦，潘迎捷，张昭寰，赵 勇。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220623-249。
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