大豆中含有丰富的蛋白质及多种人体必需氨基酸，是一种重要的植物性蛋白资源，常被加工成各种食品。然而，大豆在部分国家是优先过敏原。据统计，大豆过敏影响了大约0.2%～0.4%的人群，其在儿童中的过敏率高达13%。大豆过敏是一种重要的食物过敏反应，会引发皮肤、呼吸道及消化道症状，如皮疹、荨麻疹、哮喘、腹泻、腹痛等，严重时可导致过敏性休克。

河南工业大学粮油食品学院邢玉飞，布冠好*，陈复生等对于大豆致敏蛋白特性的深入了解及研究快速、精确和标准化的过敏原检测方法具有重要的实际意义。

Gly m Bd 30K，又称P34，是一种半胱氨酸蛋白酶，广泛存在于大豆细胞液泡中。Gly m Bd 30K是单体蛋白，其氨基酸数量为379 个，分子质量为34 ku，属于7S球蛋白，约占大豆总蛋白含量的1%，其结构如图3所示。研究发现，66.5%的大豆过敏患者对Gly m Bd 30K识别并产生过敏反应，因此认为其属于大豆中的主要致敏蛋白。同时，Gly m Bd 30K是一种糖蛋白，其N端170位氨基酸处是一个多糖链结合位点。蛋白质的糖基化位置在其致敏性方面发挥重要作用，因此Gly m Bd 30K存在一定致敏性。

1.4 Gly m Bd 28K

2 检测技术

根据识别物质的不同，目前食品过敏原的检测技术可分为基于蛋白水平和基于核酸水平的检测技术。基于蛋白质水平的检测技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹法（Western blotting）、免疫层析法、质谱法及生物传感器法；基于核酸水平的检测技术有实时定量聚合酶链式反应（qPCR）、环介导等温扩增（LAMP）技术。

2.1 基于蛋白水平的检测技术

1 ）ELISA

ELISA基于抗原-抗体的特异性结合对过敏原进行免疫测定，通过间接指标对过敏原含量进行定性或定量检测，不需要复杂或昂贵的设备。ELISA根据固定抗原方法的不同，可分为直接法和间接法，其中间接法包括夹心法及竞争法，不同ELISA方法的原理示意图如图5所示。夹心ELISA法检测灵敏度明显高于竞争性ELISA法，但更适合于未加工大豆蛋白的检测，而竞争性ELISA法则更适合检测加工后的大豆制品。基于单克隆抗体所建立的ELISA法检测精准度高于基于多克隆抗体的ELISA法。

2） 免疫印迹法

免疫印迹法又称蛋白质印迹法，是基于抗体的特异性来鉴定抗原的有效检测方法。首先进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质样品电转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。利用一抗作为“探针”，用标记的二抗进行“显色”，对样品进行检测与分析，免疫印迹法的具体步骤及原理如图6所示。免疫印迹法兼具电泳的高分辨力及免疫测定法的高特异性及敏感性等优点，可用于抗原的定性和半定量检测。相比于ELISA，免疫印迹法的灵敏度较低，对检测样品中的大豆过敏原仅能进行定性或半定量检测，但是其可以追踪不同食物加工阶段产物中所有蛋白和肽段图谱。此外，免疫印迹法可以有效避免由于蛋白抑制剂的存在导致的检测结果假阴性现象。

3） 免疫层析法

免疫层析法基于抗原-抗体的特异性结合，首先将抗体预包被于硝化纤维素（NC）膜上，待测样品通过毛细作用涌动到预包被抗体区域时被捕获，使用酶标或胶体金作为检测标志物，从而得到可视化结果，以纤维素膜上显色条带及其颜色的深浅等作为评价指标，从而实现过敏原的定性或定量检测，检测原理如图7所示。相比于ELISA法，免疫层析法虽然检测时间较短，但是其精准度较低。免疫层析法操作简单、用时较短，通过增加检测线（T线）可以进行高通量检测。为了有效提高免疫层析法的灵敏度，未来可以将单克隆抗体与新型材料标志物如荧光量子点相结合。

4） 生物传感器

生物传感器通过生物识别元件识别并响应食物中的过敏原，再由换能器将其转化为定量的光电信号来实现检测，其工作原理如图8所示。根据换能器的不同，生物传感器可以分为光学生物传感器、电化学生物传感器及压电传感器三类。作为一类新的检测方法，它具有快速、灵敏度高、自动化程度高、实时监测等优点，近年来已被广泛应用于食物过敏原方面的检测。生物传感器技术兼具免疫检测技术及光电技术的优点，在大豆过敏原检测中，选用最佳生物传感器并扩大检测范围是未来的发展热点之一。

5） 质谱法

液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法检测的基本原理是样品通过离子源从而被电离成不同带电粒子，利用加速电场使带电粒子进入质量分析器，接着在电场及磁场的双重作用下，将不同质荷比（m/z）的离子分离并计算其分子质量，最后通过计算机对蛋白质或肽段进行鉴定分析，其工作原理如图9所示。质谱方法虽然克服了免疫学技术遇到的问题，即在食品加工处理后导致蛋白质的结构发生变化后，无法有效、精准地检测过敏原，但其需要使用昂贵的设备，维护成本很高，而且需要由训练有素的人员操作。现阶段，由于质谱法具有检测灵敏度高、检测时间短、检测用量少及可进行分离鉴定等特点，已广泛应用于大豆过敏的检测中。

2.2 基于核酸水平的检测技术

1） qPCR

PCR技术是一种在体外将少量初始样品中的目的基因进行大量扩增的核酸合成技术。随着荧光化学物质的发展，基于其荧光特性实时定量监测扩增过程即为qPCR技术，其利用体外大量扩增的核酸产物来进行样品检测。可在PCR体系中加入荧光基团，通过所产生的荧光信号变化来动态监测整个反应过程。qPCR是在食品过敏原检测中应用最为广泛的一项基因水平检测技术。qPCR的特异性和灵敏度均优于普通PCR，在进行定性分析的同时，实现了在复杂食品基质中对多重过敏原的定量分析。利用PCR检测大豆过敏原容易出现假阳性或假阴性结果，因此PCR在大豆过敏原检测中的应用有所局限。

2） LAMP技术

LAMP技术是根据6～8 种不同的靶基因DNA序列开发设计出4～6 种特异性引物，60～65℃恒温下在链置换DNA聚合酶作用下进行大量扩增，短时间内可实现靶基因的特异性显著扩增。LAMP的分析检测结果通过反应体系中样品颜色等变化进行评估。与传统的PCR和qPCR检测方法相比，LAMP具有许多优点，如恒温扩增、反应时间短、检测结果可通过肉眼判断等。该方法最主要的难点在于引物的设计，其直接决定了检测方法的准确性。基于DNA的LAMP-侧向流动免疫法是一种操作简单的大豆致敏原检测方法，其显示出比商业侧向流动免疫法更高的灵敏度及特异性。

2.3 不同检测方法的对比

随着全球范围内食品多样性的增加，食品中可能含有的过敏原含量及种类不断上升，检测难度不断升高，总结和认识现有检测方法的优势与不足（表1），对于食品中不同过敏原的快速精准检测具有重要作用。