近年来肥胖症患者数量明显上升，造成肥胖的原因是体内脂肪过多堆积、脂质代谢异常。胰脂肪酶是人类脂质代谢的关键酶，可作为抗肥胖药物的特定靶点。食品来源的胰脂肪酶抑制剂，如多酚、多糖、多肽等不仅有效抑制胰脂肪酶的活性，而且安全性更高，是目前食品工业的研究热点。目前有报道沙棘籽粕蛋白可以有效降低糖尿病小鼠的体质量和体内甘油三酯的含量。活性肽是一类具有特殊生理功能的蛋白质片段，受到外界影响时，内部结构会发生变化，从而导致其性质发生改变。

在前期研究的基础上，中国水产科学研究院南海水产研究所的相欢和华南理工大学食品科学与工程学院的崔春*首先探究了温度、pH值、金属离子、光照及氧气对沙棘籽粕蛋白胰脂肪酶肽抑制活性的影响。在此基础上，为获得具有更高活性的沙棘籽粕蛋白肽（SSPA），以猪胰脂肪酶（PPL）抑制率为指标，将沙棘籽粕蛋白酶解液依次通过超滤、大孔树脂进行分离，筛选出具有较强活性的多肽，利用分子对接分析活性肽与PPL之间的作用，化学合成活性肽对其活性进行评价，以期为产业化生产沙棘籽粕胰脂肪酶抑制肽提供理论基础。

而对于其他因素如光照和氧气对SSPA活性的影响如图1D所示，在日光灯和紫外灯照射条件下，SSPA的PPL抑制率无显著变化（P＞0.05），表明该产品在实际生产中可采用紫外灭菌。SSPA的PPL抑制活性在有氧和无氧条件下无显著差异，说明SSPA在短期贮藏的过程中不会因暴露于空气而影响其生物活性。

如表2所示，SSPA及其超滤组分对PPL的IC₅₀值不同，其中SSPA的IC₅₀值最高（1 198 μg/mL），而经过超滤后其抑制效果明显增强，并且随着分子质量的降低呈现抑制增强的趋势，其中分子质量小于3 kDa的组分IC₅₀为309.8 μg/mL，收集该组分并进行后续的分离鉴定。

如图2D所示，HPD826在0～4 min内快速扩散，之后从4～150 min缓慢吸附，最终在150～240 min内吸附饱和呈现平衡状态；其余3 种树脂同样保持3 个阶段的吸附，第1阶段为表面吸附（0～5 min），第2阶段为快速吸附扩散阶段（5～180 min），最后阶段为吸附缓慢最终饱和（180～240 min）。说明4 种树脂对SSPAL的吸附不同，且表现多重性质。

HPD826树脂在整个吸附过程中效果最佳。HPD826树脂具有相对理想的表面积（500～600 cm²），并且可以通过氢键与SSPAL中的侧链氨基酸相互作用，从而发挥更好的吸附和解吸能力。如表3所示，经HPD826大孔树脂分离之后，SSPAL的胰脂肪酶抑制率显著提高，IC₅₀显著降低。

03 UPLC-MS/MS鉴定SSPA

利用UPLC-MS/MS对SSPAL-E组分进行检测。如表4所示，一级质谱图中得到多个母离子，进行分析后得到二级离子碎片的信息。SSPA中鉴定得到31 种多肽，其中含有2 个氨基酸的肽段有11 个，约占35.48%；含有3 个氨基酸的肽段有15 个。鉴定得到较多含精氨酸的多肽（19 个）。以Hippophae rhamnoides为关键词，在UniProt中进行搜索，发现大多数肽段来源于Protein TIC214，包括NN、VR、LR/IR、DR、TR、FD、EF、FR、PSP、ELR/EIR、EER和NLLHR。另外还有部分肽段来源于Protein Ycf2，包括EDS、QLF、FL(I)R和WRN。根据质谱数据（峰面积）计算得到分离组分中多肽总量为28.08%，其中VR、FR、RDR、APYR、NLLHR和EEAASLR的肽含量较高，分别为2.90%、7.40%、1.10%、1.50%、1.40%和1.10%。VR、FR和NLLHR均源于Protein TIC 214，RDR来源于Ribulose bisphosphatecarboxylase large chain，APYR来源于30S ribosomalprotein S2, chloroplastic，EEAASLR来源于PhotosystemI P700 chlorophylla apoprotein A2。使用Peptide Ranker可计算出多肽的生物活性潜力，SSPA的理论得分范围为0.036 7～0.997 1，说明其生物活性存在较大差异。据报道，预测得分超过0.5的多肽被认为具有较强的生理活性，表4中有20 个多肽得分大于0.5，可认为具有较高生物活性，根据ToxinPred分析，这20 种多肽均没有毒性，将对其进行后续分析。

04 SSPA的活性分析

4.1 分子模拟分析SSPA的活性

采用PepSite2对Peptide Ranker大于0.5的SSPA进行初步分析，继续筛选出P＜0.05的肽，分别是VR、FR、APYR、EEAASLR、RDR、NLLHR、QLF、ALPMDW、MLA和PSP。

图3结合质谱图中强度评分最终筛选出多肽序列。除PSP和MLA外，其余8 个肽的强度均高于500，多肽强度变化为：EEAASLR（16 000）＞FR（8 000）＞NLLHR（5 000）＞APYR（2 000）=ALPMDW（2 000）＞RDR（1 600）＞QLF（1 000）＞VR（600）。分子对接结合能顺序为：EEAASLR=QLF＞FR=RDR＞VR＞APYR＞ALPMDW＞NLLHR，如表5所示，结合能越小说明抑制能力越强（）。结合以上分析结果及多肽含量，选择VR（2.90%）、FR（7.40%）、RDR（1.10%）、APYR（1.50%）、NLLHR（1.40%）和EEAASLR（1.10%）进行合成分析。

4.2 SSPA与PPL结合位点分析

分子对接结果表明多肽与PPL之间至少有一种相互作用，这些相互作用（亲水作用、氢键、疏水作用、π-π相互作用/堆叠作用和范德华力）可以稳定肽-PPL复合物，并影响或改变PPL构象（图4）。氢键是抑制PPL的主要因素，以上肽段均提供了Arg（R）残基，精氨酸包含一个α-氨基、α-羧基和一个侧链胍基，因此能够通过氢键与带电残基相互作用，并通过其亚甲基与疏水残基相互作用。VR通过离子键（Asp 80）、氢键（Ser 153、Phe 78）、π-π共轭（Phe 216、Tyr 115）和疏水相互作用（Phe 216、Tyr 115）与PPL结合。FR主要通过氢键和π-π堆叠与PPL结合，其中氢键作用主要表现为NH：Phe 78（2.58 Å）、Arg 257（2.42 Å）；OH：Gly 77（3.03 Å）、His 152（2.62 Å）。π-π堆叠主要表现为Phe的苯环与PPL中的Tyr 115、Phe 216和Pro 181残基的相互作用。RDR主要通过氢键与PPL结合，PPL中的His 152、Gly 77和Arg 257与RDR中的氧原子结合，形成OH键。另外PPL中的Phe 78和His 264通过CH键与RDR结合。PPL中的Phe 78与APYR中的R基团上的N原子形成氢键，而APYR中的Tyr上的苯环与PPL中Phe 216和Phe 78中的苯环形成π-π相互作用。NLLHR与PPL的结合位点较多，主要表现为与PPL上的Phe 78（2.58 Å）、Arg 257（2.42 Å）、His 152（2.62 Å）形成氢键，此外NLLHR与PPL上的ALA 179、Pro 181、Phe 216 和Ile 79通过烷基或π-烷基作用结合。EEAASLR与PPL中的Arg 257和Phe 78形成氢键，与Phe216形成π-π相互作用。