海南大学于志鹏教授：基于虚拟筛选和分子对接鉴定鸡蛋蛋白源苦味受体T2R14阻滞肽

2023-11-22 23:32:04

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海南大学食品科学与工程学院于志鹏课题组以鸡蛋蛋白为原料，结合虚拟筛选、分子对接、电子舌体外验证以及分子动力学模拟技术筛选和鉴定新型苦味受体T2R14阻滞肽，并揭示了苦味物质与苦味受体T2R14相互作用的分子机制。

Introduction

苦味作为五种基本味觉之一，常给人带来不愉悦的感觉。苦味不仅天然存在于植物中，在食品蛋白质酶解、加热或发酵过程中也常伴随着苦味的产生，因此，苦味受体T2R14阻滞肽的筛选与鉴定对于食品工业的发展将具有重大意义。

苦味受体（T2Rs）属于G蛋白偶联受体（GPCR），可以介导苦味识别过程。T2Rs基因家族含有25 种功能性受体编码基因，可以识别多种苦味物质，其中，T2R14对苦味物质的调节范围最广，可以被多种苦味化合物激活。加强对苦味受体T2R14识别机制的研究，可以为苦味受体阻滞肽的筛选和鉴定提供更多的理论依据。

已有研究从虹鳟鱼和虾夷扇贝中筛选出具有阻滞苦味受体T2R14能力的肽序列。鸡蛋中蛋白质含量高，是生物活性肽的优质来源。本研究尝试从鸡蛋蛋白中筛选潜在的苦味受体T2R14阻滞肽。然而，传统的生物活性肽分离、纯化方法耗时长且成本高。基于计算机辅助筛选方法能省时和节约成本，可以在一定程度上对采用传统方法筛选苦味受体阻滞肽进行互补。Peptide Cutter在线酶解程序可用于预测某些代表性蛋白质释放的肽序列。目前，分子对接已被广泛用于模拟配体和受体之间的相互作用，并已被证明是计算机辅助受体-配体结合预测的重要工具。许多研究已经证明了虚拟筛选的有效性。

Results and discussion

鸡蛋蛋白虚拟酶解与筛选

采用ExPASy Peptide Cutter（http://web.expasy.org/peptide_cutter/）对鸡蛋蛋白进行虚拟酶解，... property calculator（http://www.innovagen.com/proteomics-tool）对得到的肽序列进行水溶性、生物活性以及毒性预测（见表1），筛选出来的水溶性好、生物活性好以及无毒性的肽序列。

表1蛋清蛋白活性肽活性分析

将潜在的活性肽与苦味受体T2R14进行分子对接，对接能量结果见表2。较高的“-CDOCKER_ENERGY”代表肽与苦味受体T2R14之间的亲和力更高。肽CQR、CGSR与苦味受体T2R14的对接能最高，分别为314.254 8、294.842 7 kJ/mol，已被报道的苦味受体阻滞肽LEGSLE与苦味受体T2R14对接值为277.01 kJ/mol，结果表明筛选出来的两个肽序列CQR和CGSR与苦味受体T2R14受体具有很高的亲和力，并对其进行进一步研究。
表2 分子对接结果

肽与苦味受体T2R14的相互作用机制分析
CQR、CGSR与苦味受体T2R14的分子对接结果见图1和图2。结果表明苦味受体T2R14氨基酸残基Asp168、Ile262、Ser265和Asn157与肽CQR形成氢键，同时Asp168、Ile262、Ser265和Thr182与肽CGSR形成氢键。这些氢键是肽CQR和CGSR与苦味受体T2R14相互作用的重要作用力。此外，氨基酸残基Ser265与Asp168一直是肽与T2R14的结合位点，这表明，苦味受体T2R14氨基酸残基Ser265和Asp168可能对苦味产生起到关键作用。
a.肽CQR与T2R14对接位点图；b.肽CQR与T2R14相互作用的二维平面图；c.肽CQR与T2R14相互作用的三维模型。
图1 肽CQR与苦味受体T2R14分子对接结果

a.肽CGSR与苦味受体T2R14对接位点图；b.肽CGSR与苦味受体T2R14相互作用的二维平面图；c.肽CGSR与苦味受体T2R14相互作用的三维模型。
图2. 肽CGSR与苦味受体T2R14分子对接结果
肽CQR、CGSR与苦味受体T2R14的分子动力学模拟结果见图3。图3a表明，15 ns后RMSD值达到平衡，在稳定状态下，CQR-T2R14复合物和CGSR-T2R14复合物的RMSD分别在0.38 nm和0.36 nm左右波动。复合物的RMSD涨落值均在合理范围内，说明模拟后体系中复合物的结构处于平衡状态；图3b显示两种复合物的曲线波动趋势相似，说明结合过程中氨基酸的波动是相似的。在两条曲线的末端，RMSF值都较高，这可能是由于肽两端氨基酸的高柔韧性，有利于肽与T2R14的结合；图3c显示CQR-T2R14复合物和CGSR-T2R14复合物在40 ns模拟过程中波动较小，波动范围在2.09 ~ 2.21 nm，表明受体与苦味阻断肽具有较高的亲和力。因此，肽CQR、CGSR与苦味受体T2R14结合后具有较高的稳定性。

a. COQ-T2R14和CGSR-T2R14分子动力学模拟过程中复均方根偏差（RMSD）随时间的变化；b. COQ-T2R14和CGSR-T2R14分子动力学模拟过程中残基复均方根波动（RMSF）差异的变化；c. COQ-T2R14和CGSR-T2R14的折叠状态和整体构象分析。
图3 COQ-T2R14和CGSR-T2R14分子动力学模拟结果
Conclusion
从鸡蛋蛋白中筛选并鉴定出两种新的苦味受体T2R14阻滞肽CQR和CGSR。分子对接结果表明，Ser265和Asp168可能在肽CQR和CGSR发挥苦味阻滞过程中起关键作用，氢键是肽和苦味受体相互作用的关键作用力。这项工作为筛选苦味受体T2R14阻滞肽提供了新思路，并且有助于解决食品工业中的苦味困扰问题。
Abstract
Bitter taste receptors (T2Rs) perform crucial role in the sensation of bitterness, especially the T2R14 that can widely perceive the bitterness. In this study, egg protein-derived T2R14 blocking peptides were identified using physicochemical property prediction, molecular docking, molecular dynamic simulation, and in vitro validation. The ‘-CDOCKER_ENERGY’ values of peptides CQR and CGSR were higher than the positive control LEGSLE, were 314.26 and 294.85 kJ/mol, respectively. The results showed that the half inhibitory concentration (IC50) of the egg protein-derived peptides CQR and CGSR were 382.87 and 370.13 μmol/L, respectively, and higher than that of the positive control LEGSLE. The molecular docking results showed that the conventional hydrogen bond interaction was the main binding force between T2R14 and peptides (i.e., CQR and CGSR). In summary, the novel T2R14 blocking peptides CQR and CGSR were identified, and aided in understanding the mechanism responsible for T2R14 blocking peptides. This study provides further guidance to block T2R14 and may address the bitterness problem in the food industry.

专家及作者介绍

于志鹏教授
海南大学食品科学与工程学院
于志鹏，男，海南大学食品科学与工程学院，高聘教授，九三学社社员，研究生导师，海南自由贸易港高层次人才，海南省“三区人才”，中国畜产品加工研究会青年工作委员会委员，中国蛋品加工业杰出青年，Food Science of Animal Products编委， Frontiers in Nutrition 专刊客座主编。近5年，主持国家自然科学基金项目2项，国家重点研发计划子课题1项，省重点攻关项目等纵向科研项目4项，企业委托横向课题4项，获省自然科学学术成果奖3项。研究主要集中于ACE抑制肽（降血压活性肽）、降血糖活性肽、免疫调节活性肽和抗老年痴呆活性肽的酶解制备、结构鉴定；基于分子模拟的作用机制及稳态化保护机制研究；基于食品组学技术探究活性肽的体内作用机制。近年来，以第一作者/通信作者发表活性肽相关的SCI检索论文54篇（其中，中科院大类分区一区29 篇）；申请有关活性肽等功能因子的国家发明专利51 项，其中以第一发明人获得授权国家发明专利19 项，完成成果转化1 项。

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